К вопросу об особенностях изменчивости STR локусов у представителей этнических бурят Байкальского региона

Publication in electronic media: 25.09.2012 under http://journal.forens-lit.ru/node/741
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2012 Вып. 18

г. Иркутск

Экспертиза вещественных доказательств, к разновидности которых относится исследование объектов биологического происхождения, относится к числу экспертиз, назначаемых по делам о наиболее тяжких преступлениях против личности. Результаты исследований крови, выделений и других биологически объектов нередко оказываются решающими при определении причастности лица к совершенному преступлению.

Идентификационное исследование основывается на изучении генетически обусловленных признаков, природа которых может быть различна. Первыми молекулярными маркерами были маркеры на основе белкового полиморфизма. Они оставались единственными вплоть до 1980 года, когда были предложены маркеры, основанные на полиморфизме генетического материала (ДНК). До 1988 года разнообразие ДНК-маркеров было невелико, но с изобретением полимеразной цепной реакции (ПЦР) ситуация изменилась и на сегодняшний день эксперт располагает большим количеством самых разнообразных ДНК-маркеров, различающихся по своим свойствам и информативности. Одним из таких методов, ставший уже классическим, является анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК с помощью гель-электрофореза с последующей визуализации электрофоретической картины путем окрашивания серебром. В роли индивидуализирующих личность признаков выступают конкретные варианты (аллели) исследуемых локусов, свойственных данному человеку – своего рода маркеры индивидуальности.

Результаты сравнительного анализа генетической вариабельности идентификационных локусов у неродственных индивидуумов, проживающих на различных территориях, свидетельствуют о достоверных различиях даже у представителей одной национальности.

В связи с этим изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-медицинского типирования ДНК в этнически дифференцированном населении Российской Федерации представляется важной и актуальной исследовательской задачей.

Изменчивость коротких тандемно повторяющихся последовательностей (STR-Short Tandem Repearts), или микросателлитов, диспергированных по всему геному человека, активно изучается в связи с проблемами ДНК-идентификации личности и определения степени генетического родства между индивидами (Корниенко И.В., Земскова Е.Ю., и др., 2002; Пушкарев В.П., Рахманина Л.В., и др., 2004; Деренко М.В., Czarny J., и др., 2007). В настоящей работе проведено систематизированное исследование распределения аллелей локусов F13B, TPOX, vWA, CSF1PO, D3S1358, D5S818 среди представителей бурят - коренного населения Байкальского региона Восточной Сибири не являющихся кровными родственниками.

Экспериментальная часть

Геномную ДНК выделяли из периферической крови с помощью стандартного метода, включающего обработку крови детергентом (1%-ный раствор додецилсульфата натрия) и протеиназой К (“Sigma”), а также очистку ДНК с помощью фенола и хлороформа (Schneider S. et al., 2000). Исследованная выборка состояла от 203 до 234-го неродственного индивидуума представителей бурят (по паспортным данным и опросам родственников) байкальского региона Восточной Сибири из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз по гражданским и уголовным делам.

Типирование аллельных вариантов проводили с помощью полимеразной цепной реакции путем энзиматической амплификации исследуемых локусов. Исследования выполняли на амплификационных наборах, разработанных в лаборатории НПФ «АТГ-Биотех» (Москва) и рекомендованным к применению территориальным судебно-медицинским лабораториям системы Минздравсоцразвития (регистрационное удостоверение № ФС 012а2004/1631-05).

Полимеразную цепную реакцию (Saiki R.K. et al.,1988) проводили на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) в строгом соответствии с рекомендациями производителя наборов реагентов. Продукты полимеразной цепной реакции анализировали путем электрофореза в 8% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (8% ПААГ с 8М мочевиной) с последующим окрашиванием геля серебром. Аллельные варианты идентифицировали с помощью специфичных аллельных маркеров лестниц (аллельных «лестниц»), входящих в комплектацию наборов реагентов. Специфичность проведенных реакций оценивали по введенным «положительным» и «отрицательным» контролям.

Для расчета частот встречаемости аллелей микросателлитов использовали программу PowerStats v.1.2. (“Promega Corp.”). Консервативные значения аллельных частот вычисляли как величину верхней границы 95% доверительного интервала.

Ожидаемую гетерозиготность (Н_exp) и параметры информативности полиморфизма исследованных микросателлитов, представляющие судебно-медицинский интерес, также как дискриминирующий потенциал, индекс полиморфизма, вероятность случайного совпадения, потенциал исключения и усредненный индекс отцовства, вычисляли с помощью программы PowerStats v.1.2. (“Promega Corpjration”).

Возможные отклонения генотипических частот исследованных локусов от равновесия Харди-Вайнберга (РХВ) проверяли при помощи пакета компьютерных программ Arleguin v.3.11 (Schneider S., Roessli D., Excofier L.,2000) с использованием модифицированного алгоритма «марковских цепей» - теста, аналогичного точному тесту Фишера, а так же по критериям X2 и G-статистики с использованием компьютерной программы RxC (Rows x Columns) на основе алгоритма описанного (Roff D.,A., Bentzen P., 1989).

Результаты и обсуждение

В таблице 1 представлены данные о распределении частот аллелей шести STR-локусов (F13B, TPOX, vWA, CSF1PO, D3S1358, D5S818) у представителей популяции бурят Байкальского региона Восточной Сибири.

По результатам различных тестов, наблюдавшееся распределение генотипов для исследованных локусов не отклонялось от РХВ. Показано, что наблюдаемое в популяции бурят байкальского региона распределение частот генотипов значимо соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, что указывает на однородность исследованной выборки. Результаты тестов хорошо коррелируют между собой, что с учетом объема выборки позволяет заключить о действительном отсутствии отклонений от РХВ для изученных локусов.

В популяции бурят Байкальского региона Восточной Сибири изученные локусы оказались не вариабельными по уровню молекулярного разнообразия (ни в одном не установлено число наблюдаемых аллелей >10, PIC>0,8). Высокое значение индекса дискриминации (PD)- 0, 915, определено только для одного из шести исследованных локусов – vWA.

Таблица 1. Частоты встречаемости аллелей и другие статистические параметры для шести STR-локусов у бурят Байкальского региона Восточной Сибири.

Примечание. МР – вероятность случайного совпадения генотипов; PD – дискриминирующий потенциал; PIC – информационное содержание полиморфизма; РЕ – исключающий потенциал; PI – индекс отцовства; H(ob) – наблюдаемая гетерозиготность; H(ex) – ожидаемая гетерозиготность, ; n - число хромосом.

Заключение

Таким образом, сравнение параметров информативности позволяет выделить только один локус vWA из шести изученных, как существенно более информативный. Данный локус характеризуется более высоким уровнем полиморфизма (9 аллелей) для популяции бурят. В связи с этим представляется перспективным исследование изменчивости других полиморфных STR-локусов для уточнения их базовых оценочных характеристик для информативного использования в идентификационном анализе бурят Байкальского региона Восточной Сибири.

Список литературы

1. Деренко М.В., Дамбуева И.К., Малярчук Б.А. и др. Структура и разнообразие митохондриального генофонда коренного населения Тувы и Бурятии по данным о рестрикционном полиморфизме // Генетика. 1999. Т.35. №12. С.1706-1712.
2. Деренко М.В., Czarny J., Малярчук Б.А., и др. //Изменчивость пятнадцати аутосомных микросателлитных локусов ДНК в пяти популяциях коренного населения Южной Сибири, 2007. Молекулярная биология. -41, -С. 593 – 600.
3. Иванов П.Л., Пименов М.Г., Наседкина Т.В. и д.р. //Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф., посвящ.75-летию РЦСМЭ. Москва, 17 – 20 октября 2006. – С.190 – 191.
4. Земскова Е.Ю. Изучение аналитических характеристик молекулярно-генетических индивидуализирующих систем в аспекте судебно-экспертного типирования ДНК: Дис…. канд.медицинских наук. – М. – 2008.
5. Корниенко И.В., Земскова Е.Ю., Фролова С.А. и др. //Исследования аллельного полиморфизма молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе тетрануклеотидных тандемных повторов LPL, vWA, TH01среди населения России. Судебно-медицинская экспертиза. -45, 2000. -С 12 – 14.
6. Малярчук Б.А., Wozniak M., Czarny J. и др. //Вариабельность 15 аутосомных микросателлитных локусов ДНК в Русской популяции, 2007.Молекулярная биология 41,3– 7.
7. Пушкарев В.П., Рахманина Л.В., Новиков П.И., Иванов П.Л. // Исследование с помощью капиллярного электрофореза аллельного разнообразия микросателлетных локусов D16S539, F13B, FESFPS, TH01 и TPOX у европеоидов Уральского региона России. Судебно-медицинская экспертиза. -2004, 47, -С 23 – 28.
8. PowerStats, Versio 1.2 Promega Corporation. Madison. WI, USA. http//www.promega.com /geneticidtools/powerstats/ PowerStatsV12.xis
9. Schneider S., Roessli D., Excoffier L. 2000. Arlequin ver.3.11: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland.
10. Компьютерная программа RхC G.Сarmody, Карлетонский университет, Оттава, Канада