Судебно-химическое исследование пиразинамида в биожидкостях

Publication in electronic media: 13.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/538
Publication in print media: Судебная медицина и медицинское право: Актуальные вопросы. Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти Заслуженного деятеля науки РФ, профессора Г.А.Пашиняна. – Москва 2011

П.В.Никитин

ГУЗОТ «Кемеровское областное бюро судебно-медицинской экспертизы»,

г. Кемерово

Среди лекарственных веществ, недостаточно изученных в судебно-химическом отношении, находится и пиразинамид. Пиразинамид – амид пиразинкарбоновой кислоты - активный туберкулостатик, широко применяемый в комплексной терапии туберкулеза. Суточная доза его для взрослых – 1,5-2,0-2,5 г в сутки [1]. При передозировке возможны острые, в том числе и смертельные, отравления. В практике нашего отделения за последние два года мы трижды сталкивались с необходимостью проведения целенаправленных исследований на пиразинамид.

В фундаментальных зарубежных руководствах по токсикологической химии [4,5] мы обнаружили следующую основную информацию об этом веществе. Растворимость в воде – 1,6 г на 100 г, в этаноле – 0,9 г; хорошо растворим в хлороформе и эфире; хорошо экстрагируется из нейтральной среды, либо эфиром в широком диапазоне рН 1-11; связываемость с белками плазмы – около 50%; характерная цветная реакция – коричнево-оранжевое окрашивание с реактивом Несслера; ТСХ – на силикагеле в системе этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1) Rf 0,71, в системе метанол-25% раствор аммиака (100:1,5) Rf 0,63; обычно используемыми «общими» проявителями не визуализируется. Для подтверждения пиразинамида удобно использовать СФМ в УФ-области: максимумы поглощения в 0,1 н растворе кислоты – 269 нм (удельный коэффициент поглощения – 659; по другому источнику – 652) и 310 (312) нм; спектр не изменяется при подщелачивании. Единственную отечественную статью, посвященную практическому судебно-химическому исследованию пиразинамида [3], мы, к сожалению, обнаружили уже позднее.

Пиразинамид входит в базу данных БД-2003-250(500) «Хроматографические и спектральные параметры УФ-поглощающих веществ», реализованную на высокоэффективном жидкостном хроматографе Милихром А-02 со стандартизированными колонкой и градиентным элюентом [2]. Но из-за малого времени (объема) удерживания его в этих стандартных условиях, приходящегося на область соэкстрактивных веществ, мы решили не применять имеющуюся у нас в то время ВЭЖХ-систему для подтверждения и количественного определения пиразинамида.

В одном из наших случаев изолирование пиразинамида из содержимого желудка проводили прямой экстракцией диэтиловым эфиром при физиологическом значении рН (из 5 мл объекта – дважды по 10 мл эфиром), добавив для улучшения разделения фаз при центрифугировании в эмульсию около грамма безводного сульфата натрия. Все полученное извлечение, после упаривания до небольшого объема, равномерно наслаивали в пять точек на хроматографическую пластинку с закрепленным гипсом слоем силикагеля и хроматографировали в системе этилацетат-этанол-25% раствор аммиака (17:2:1) параллельно свидетелю – спиртовому раствору пиразинамида. Зону одной из точек извлечения и зону свидетеля опрыскивали реактивом Несслера – наблюдали пятна, вначале – белые на слабо-оранжевом фоне (из-за «остаточного» аммиака), затем, после обесцвечивания фона – слабо-оранжевые, с Rf 0,68, на одном уровне в обеих зонах. Слой силикагеля в зонах остальных четырех точек извлечения на уровне пятна соскабливали, элюировали 0,1 н раствором соляной кислоты, центрифугировали и снимали спектр поглощения в диапазоне длин волн 220-330 нм на спектрофотометре СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Полученные картины спектров пиразинамида, извлеченного из биоматериала и стандартного раствора препарата были аналогичными и соответствовали приведенным выше литературным данным. После подщелачивания растворов в кюветах до рН 12 добавлением 2 капель 30% раствора едкого натра до рН повторно снимали спектр поглощения в указанном интервале длин волн – спектральная картина не изменилась. Количественное определение проводили по оптической плотности кислого раствора при 269 нм и значения удельного коэффициента поглощения 659; концентрация пиразинамида в содержимом желудка – без учета выхода методов, примененных для изолирования и очистки препарата - составила 27 мкг/мл. Для дополнительного подтверждения пиразинамида к щелочному раствору после СФМ-исследования добавляли избыток гидрокарбоната натрия, дважды извлекали небольшими порциями эфира и, после упаривания до минимального объема, наслаивали на пластинку «Сорбфил», параллельно спиртовому раствору свидетеля. Хроматографировали в системе этанол-25% раствор аммиака (100:1,5), опрыскивали смесью концентрированной соляной кислоты и этанол (1:4) и затем нагревали пластинку при 90 оС – наблюдали слабые розово-фиолетовые пятна с Rf 0,80 на одном уровне в обеих зонах (возможность применения этого проявителя также описана в [5]).

Однако для оценки степени отравления необходимо было провести еще исследование крови с количественным определением. От прямой экстракции крови эфиром при физиологическом значении рН – по аналогии с содержимым желудка - решено было отказаться по техническим трудностям (образование устойчивой эмульсии), а также по причине существенных предполагаемых потерь из-за связи вещества с белками плазмы. Способы разрушения связи с белком, применяемые обычно в таких случаях – добавление кислоты при экстракции (реже – щелочи, кислотного или щелочного гидролиза) решено было не применять из-за плохо выраженных рН-свойств пиразинамида и возможного загрязнения экстракта. Чтобы использовать в качестве экстрагента диэтиловый эфир при нейтральном значении рН среды, решено было перед этим провести депротеинизацию крови. В связи с этим изолирование проводили в двух вариантах. В первом к 3 мл крови добавляли 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты (0,5 г/мл) и 4 мл воды, взбалтывали 10 минут, центрифугировали, к центрифугату добавляли 10% раствор едкого натра до рН 6-7 по универсальному индикатору, воду до объема 20 мл, около 1 г безводного сульфата натрия и трижды извлекали эфиром, порциями по 10 мл. Во втором к 3 мл крови добавляли 10 мл ацетона, взбалтывали 10 минут, центрифугировали, к центрифугату добавлял воду до объема 20 мл, 1 г безводного сульфата натрия и аналогичным образом трижды по 10 мл извлекали эфиром. Эмульгирование при извлечении в обоих вариантах было незначительным, извлечения получились визуально одинаково чистыми. Но при ТСХ-исследовании аликвоты извлечения, соответствующей 1 мл крови, как описано выше, в первом варианте характерных пятен на хроматограмме (после проявления реактивом Несслера) не наблюдали; характерного спектра – из оставшейся части извлечения – не получили. Второй вариант депротеинизации оказался не только более простым в выполнении, но и позволил обнаружить пиразинамид с помощью ТСХ, а также подтвердить его по УФ-спектру поглощения. При количественном определении получили концентрацию пиразиамида в крови 12,5 мкг/мл. Поскольку данный результат был получен без учета выхода методов, примененных для изолирования и очистки, впоследствии аналогичным образом изолировали и исследовали два образца интактной крови через сутки после затравки пиразинамидом в концентрации 100 мкг/мл. При количественном определении выход препарата при изолировании составил 21,7 и 18,8%, в среднем – 20%. Таким образом, с учетом выхода изолирования и очистки, концентрация пиразинамида в исследуемой крови составила 62 мкг/мл. По данным Международной Ассоциации судебных токсикологов (1996 г.), концентрация пиразинамида в сыворотке крови человека 30-75 мкг/мл считается терапевтической, летальная концентрация не указана. Но с учетом обстоятельств дела, клинической картины (смерть девушки, 13 лет, произошла после приема 50 таблеток пиразинамида в присутствии врачей «реанимобиля», проводивших детоксикационную терапию), на основании результатов судебно-химического исследования, экспертом-танатологом был сделан вывод о смерти девушки вследствие отравления пиразинамидом.

Применение ацетона в качестве депротеинизатора крови представляется нам перспективным при изолировании и других лекарственных средств, обладающих слабо выраженной рН-функцией, сильной связью с белками плазмы, либо хорошо растворимых в воде и требует дальнейшего практического изучения.

Использованные источники

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.II.-12-е изд., перераб. и доп. - М.:Медицина, 1993.-С.384.
2. Хроматограф «Милихром А-02». Определение веществ с применением баз данных «ВЭЖХ-УФ». Сборник /сост. Г.И.Барам. - Новосибирск, 2005.-64 с.
3. Юсупова Ф.Г. Изолирование и идентификация пиразинамида // Проблемы экспертизы в медицине.-2005.-№ 2.-С.39-40.
4. Clarke`s isolation and identification оf drugs in pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material. - London, 1986.- Р.947-948.
5. Toxicological Analysis /ed. by R.K.Mueller. - Leizig: Edition MOLINApress, 1995.-Р.410, 633.