Использование колориметрического метода для целей судебно-биологического отделения

Publication in electronic media: 13.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/537
Publication in print media: Судебная медицина и медицинское право: Актуальные вопросы. Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти Заслуженного деятеля науки РФ, профессора Г.А.Пашиняна. – Москва 2011

Т.В. Найденова

Кафедра судебной медицины ГОУ ВПО ИГМА, г. Ижевск

Следы крови играют важную роль в следственной практике, поскольку они могут свидетельствовать о происшествии или совершенном преступлении. Вопросы, решаемые в судебно-биологических отделениях при проведении экспертиз следов крови, определяются как обстоятельствами дела, так и экспертными возможностями. Наиболее часто по следам крови можно установить механизм их образования, видовую и групповую принадлежность. Реже органы следствия ставят вопросы о половой и возрастной принадлежности, региональном происхождении. Вопрос о давности происхождения пятен крови является не менее важным в установлении обстоятельств дела, но отсутствие достоверных методик или их трудоемкость затрудняют возможности экспертов-биологов ответить на него.

Со временем в пятнах крови происходят различные физико-химические и биохимические изменения, сопровождающиеся разрушением белков, изменением концентрации ионов и ферментов. Процесс «старения» пятен индивидуален в каждом случае и зависит как от свойств предмета-носителя, так и от условий внешней среды при которых оно хранилось [1].

Для разрешения вопроса о давности образования следов крови одной из первых была предложена методика определения степени изменения их цвета. Однако зависимость от субъективного цветовосприятия исследователя, температурных и погодных условий, попыток уничтожения пятен, а так же других обстоятельств, которые необходимо учитывать при оценке, сделала эту методику непригодной для целей судебной медицины [9].

Был предложен и ряд других методов:

• скорость обесцвечивания в различных растворителях, таких как водный раствор мышьяковистой кислоты, хлорная вода по Драгендорфу, а так же сравнение интенсивности цвета исследуемого пятна, растворенного в дистиллированной воде или растворе калийной щелочи, с контрольными образцами по Мюллеру [2];
• определение активности ферментов крови: холинэстеразы, лейцинаминопептидазы и окситоциназы в зависимости от условий и давности хранения [3];
• исследование выхода ионов хлора за пределы границы пятна и распространение их по предмету-носителю [7, 10];
• установление изменений спектра гемоглобина и его дериватов при «старении» пятна крови [6, 8].

Учитывая актуальность исследований пятна сухой крови для суждения о давности его образования, мы предприняли попытку изучения оптической плотности вытяжек из этих пятен. В качестве биофизического метода был избран общедоступный и простой метод колориметрии, не требующий специальных знаний и подготовки.

Забор крови осуществлялся соответственно правил приказа Минздрава РФ №161 от 24 апреля 2003 г. [5] у трупов обоих полов без учета причины смерти, наличия алкоголя, возраста, с давностью смерти, не превышающей одних суток. Непосредственно после забора кровь выливалась на четырехслойную стерильную марлю, помещенную в чашки Петри, и высушивалась в течение двух суток при комнатной температуре без доступа прямых солнечных лучей. Далее каждый образец заворачивался в бумагу, отмечался порядковый номер, дата забора материала, номер акта вскрытия и хранился при комнатной температуре.

Из образцов крови вырезались кусочки 1×1 см и взвешивались в сравнении с чистыми кусочками той же марли, таким образом, осуществлялось вычисление веса сухой крови. Каждый кусочек помещался в пробирку с соответствующим номером и заливался 2 мл дистиллированной воды. Для контроля отдельно в пробирку помещалась такое же количество дистиллированной воды. Экспозиция составляла 18-20 часов в условиях комнатной температуры. Затем после встряхивания, пробирки с вытяжками и контролем центрифугировались в течение 5 минут при 1500 об/мин. Измерение оптической плотности осуществлялось с помощью фотоколориметра КФК-3 и двух стандартных заводских кварцевых кювет 1,040, толщина слоя которых 10 мм. Использовался дифференциальный метод, сущность которого заключается в измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, это приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной ошибки анализа до 0,5-1%. В одну из кювет, расположенную в кюветном отделении, помещался образец дистиллированной воды (контроль), в другую образец вытяжки (анализируемый раствор). При помощи контрольной кюветы устанавливали на нуль шкалу оптической плотности прибора. Затем переводили на кювету, заполненную анализируемым раствором, и измеряли оптическую плотность по отношению к контролю в области от 330 до 500 нм с интервалом 10 нм.

Замеры осуществлялись с интервалом семь дней в течение первого месяца от забора крови, в последующем через каждый месяц.

Анализ полученных результатов осуществлялся в соответствии с правилами, принятыми для медицинской статистики [4]: вычисление среднего значения, ошибки средней, стандартного отклонения, дисперсии, t-критерия Стьюдента, критерия Ньюмена-Кейлса, корреляции Пирсона. Для проведения расчетов и оформления полученных результатов использовались персональный компьютер, программа обработки электронных таблиц Microsoft Excel, текстовый процессор Microsoft Word.

Значения средней величины оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности представлены на рисунке 1. Обращаем внимание, что данные величины определялись для всех примененных нами в исследовании длин волн (от 330 нм до 500 нм). Таким образом, получено 18 групп. На рисунке представлены результаты исследования только для длины волны 440 нм, на которой отмечены наиболее отчетливо регистрируемые изменения.

Общее количество изученных объектов составило 215 образцов. Количество наблюдений в группах, сформированных по принципу давности пятна крови (1 нед., 2 нед. и т.д.), варьировало от 12-и до 36-и.

Рис. 1. Средние значения оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности (длина волны 440 нм)

Основным вопросом, подлежащим разрешению в ходе настоящего исследования, являлось установление принципиальной возможности использования метода изучения оптической плотности вытяжек из пятен крови для определения давности этих пятен. Для ответа на этот вопрос необходимо определить – имеются ли достоверные различия между величинами оптической плотности вытяжек из пятен крови соответственно групп, представленных на рисунке 1.

После проведения проверки нормальности распределения данных в исследованных группах, подтвердившей факт существования таковой и проверки равенства их дисперсий [4], было проведено сравнение средних значений оптической плотности сформированных групп. В качестве метода сравнения выбран критерий Ньюмена-Кейлса, продемонстрировавший следующее (Таблица 1).

Между многими из выделенных групп регистрируются достоверные различия, что свидетельствует о том, что ряд изменений, происходящих с течением времени с кровью в пятне, приводит к изменению оптической плотности вытяжек из этого пятна, создавая принципиальную возможность использования предлагаемого нами метода для решения поставленных задач.

Таблица 1 Сравнение по критерию Ньюмена-Кейлса средних значений оптической плотности вытяжек крови из пятен различной давности (длина волны 440 нм)

* Достоверные различия при P≥95.

Естественно, что практическое применение предлагаемого метода изучения оптической плотности невозможно без установления вида математической зависимости, лежащей в основе выявленных нами изменений.

Рис. 2. Динамика дифференциальных величин оптической плотности вытяжек из пятен крови различной давности

Как показали исследования (Рис. 2), в первые 4 недели наблюдается постепенное повышение оптической плотности вытяжек из пятна крови, происходящее по линейному закону. В последующем, начиная с 4-й недели, происходит уменьшение изучаемой величины, описываемое, в данном случае, полиномиальным трендом второй степени. Представленные на рисунке величины достоверности аппроксимации свидетельствуют о хорошем описании данными математическими законами реально наблюдаемых изменений (R² от 0,95 до 0,99).

Таким образом, на данном этапе исследования, изложенное выше позволило сформировать следующие выводы:

1. Изменения крови в пятне, происходящие с течением времени, приводят к объективному изменению величины оптической плотности вытяжек из этого пятна, что позволяет достоверно дифференцировать различные «сроки давности» пятен крови.
2. Зарегистрированные изменения в течение первых 4-х недель происходят по линейному закону, с достоверным увеличением регистрируемых параметров и последующим их уменьшением, описываемым полиномиальной зависимостью второй степени.
3. Изучение оптической плотности может быть использовано в практике судебно-медицинских экспертиз в качестве дополнительного инструментального метода исследования сухой крови, в случаях необходимости установления сроков образования пятен крови на вещественных доказательствах.

Использованные источники

1. Вейдиня М. Р. Следы крови (доэкспертное криминалистическое исследование). – Рига: «Совлат», 1973. – 312 с.
2. Геньбом Р. Г., Корнеева-Асадчих Н. П. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. – М., 1972. – 203 с.
3. Гладких А. С., Гужеедов В. Н. О возможности определения давности образования следов крови по активности сывороточных изоферментов // Актуальные проблемы судебной медицины. – М., 1972. – С. 144-146.
4. Гланц С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / под ред. Н. Е. Бузикашвили, Д. В. Самойлова. – М., 1999. – 459 с.
5. Об утверждении Инструкции по организации и производству экспертных исследований в бюро судебно-медицинской экспертизы / Приказ Минздрава РФ № 161. – М., 2003.
6. Туманов А. К., Гуров Ф. И. К возможности применения спектров отражения для решения вопроса о давности следов крови // Судебно-медицинская экспертиза – М., 1973. – т. 4. – С. 25-29.
7. Туманов А. К., Самусева Г. С. Некоторые данные о хлоридном методе установления давности пятен крови и спермы // Материалы III Всесоюзного совещания судебно-медицинских экспертов и III Всесоюзной конференции научного общества судебных медиков и криминалистов. – Рига, 1957. – С. 111-112.
8. Шалаев Н. Г. Метод фотоколориметрического исследования в определении давности кровяных пятен. Дис. канд. мед. наук. – Горький, 1954.
9. Шамонова Т. Н. Следы крови человека в криминалистическом учении о следах // Вестник криминалистики. - М.: Спарк, 2004. – Вып. 4. – С. 71-80.
10. Weinig E. Eine Methode zer Altersbestimmung von Blut- und Spermale lecken. – “Dtsch.Z/ges. Ger. Med.”. – 1954. – Bd 43. – S.1-10.