Эффективность использования метода фиксации при заборе органов и тканей для электронного микроскопического исследования

Publication in electronic media: 3.06.2010 under http://journal.forens-lit.ru/node/156
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15

С. В. Савченко, И. В. Степанищев, Е. В. Кузнецов

г. Новосибирск

Электронная микроскопия является методом морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющих изучить структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточ­ном уровнях. После выпуска первой промышленной модели просвечи­вающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, электронная микроскопия прошла большой путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроско­пия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусо­логии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Бла­годаря электронной микроскопии была раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, мик­ротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток. Электронная микроскопия позволила понять многие тонкие ме­ханизмы развития болезней, в том числе на ранних этапах их возникно­вения, еще до появления четкой клинической симптоматики. Исследова­ния строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов. Использование электронной микроскопии в сочетании с другими методами, например, с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими, обусловило появление электронной авторадио­графии, электронной гистохимии, иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и других. Это позволило значитель­но расширить информацию, получаемую с помощью электронной мик­роскопии, наблюдать структурное выражение течения биохимических процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектичес­кое единство структуры и функции.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследо­вания методика такой подготовки может быть различной. Однако не­пременным условием для любых электронно-микроскопических ис­следований является фиксация тканей с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существуют два принципиально различных способа фиксации: химический и физический, каждый из которых име­ет различные варианты. В электронной микроскопии, как правило, ис­пользуют химическую фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами.

Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задачи конкретно­го исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе химических фиксаторов исходят из их способности коагулировать бел­ки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовоксильный калий и др). Существуют оптимальные сроки взятия различных тканей и клеток, обычно исчис­ляемые минутами. Чем раньше ткань помешают в фиксатор, тем более достовернее данные получают о прижизненной структуре клеток. Фик­саторы обладают различной скоростью проникновения в ткань: от этого зависит возможная величина объекта исследования.

В настоящее, время электронная микроскопия приобретает огром­ную значимость как в практической деятельности, так и в научной. В виду того, что электронные микроскопы во многих бюро судебной ме­дицины отсутствуют, и материал приходиться в кратчайшие сроки фик­сировать и транспортировать в лабораторий электронной микроскопии, мы посчитали целесообразным провести сравнение двух фиксирующих растворов. Для сравнения мы взяли осмиевый фиксатор и фиксатор, со­держащий 4% параформ и 0,2% глутаральдегид на фосфатном буфере с рН 7,4. Существенной разницы при изучении и органов и тканей пос­ле фиксации в этих растворах мы не наблюдали, но некоторые отличия по составу и качеству имеются. Так, четырехокись осмия и глутаровый альдегид проникают в ткань на 0,1-0,5 мм примерно за 1 — 1,5 часа, но для некоторых тканей оно может быть увеличено до 4 часов или до 20-30 мин. В отдельных случаях допускается в течение одних суток. На­ибольшее распространение получила фиксация материала в глутаровом альдегиде. Глутаровый альдегид достаточно хорошо фиксирует белки, но при этом стабилизация липидов недостаточна. По сравнению с ши­роко применяемым последние годы другим альдегидным фиксатором — глутаральдегидом — параформальдегид обладает рядом несомнен­ных преимуществ. Главное из них — большая скорость проникновения в ткани, что очень важно для предотвращения аутолитических измене­ний в образце, развивающихся уже во время фиксации. При глутараль-дегидной фиксации удовлетворительное состояние ультраструктурных компонентов клеток прослеживается на глубину не более 1мм, в то время как параформальдегидный фиксатор сохраняет для электронно-микроскопического исследования всю ткань образца в объеме 3,5 см2 (Winbom, Seeling 1970). Кроме того, фиксирующий раствор на основе параформа существенно увеличивает срок хранения тканей, — как по­казали исследования Целлариуса и соавт, (1980), структура клеточных органелл полностью сохраняется в течение 3-4 месяцев. Таким образом, фиксирующий раствор на основе глутарового альдегида и параформа позволяет существенно увеличить срок сохранения в неизмененном виде органов и тканей, что существенно влияет на более эффективное исследование и может использоваться при необходимости в экспертной практике.