Изучение психоактивного воздействия jwh-250 (spice, спайс) на лабораторных животных

Publication in electronic media: 07.04.2013 under http://journal.forens-lit.ru/node/964
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и медицинского права. Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора В.О. Плаксина – Москва 2011

Кафедра токсикологической химии, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России, г. Пермь

Особую опасность в настоящее время и в ближайшем будущем будет представлять распространение новых синтетических психоактивных веществ, обладающих высокой специфичностью действия и эффективностью даже в малых количествах. В ходе проведения экспертных исследований на базе Регионального испытательного центра «Фарматест» Пермской государственной фармацевтической академии сотрудники центра неоднократно сталкивались с проблемой формирования выводов в отношении химических веществ, не включенных в Перечень наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в РФ, утвержденный постановлением Правительства № 681 от 30.06.1998 г. [2], и «Списки сильнодействующих и ядовитых веществ», утвержденный постановлением Правительства № 964 от 29.12.2007 г. Эти вещества могли бы быть отнесены к аналогам наркотических средств или психотропных веществ при условии доказательства двух составляющих, обуславливающих принадлежность к аналогам в соответствии с Федеральным законом № 3-ФЗ «О наркотических средствах и психотропных веществах» – сходство химической структуры и психоактивных свойств [1].

В статье 1 Федерального закона «О наркотических средствах и психотропных веществах» записано: «Аналоги наркотических средств и психотропных веществ – запрещенные для оборота в РФ вещества синтетического или естественного происхождения, не включенные в перечень наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в РФ, химическая структура и свойства которых сходны с химической структурой и свойствами наркотических средств, психотропных веществ, психоактивное действие которых они воспроизводят».

В данной работе рассматриваются возможности комплексного изучения нарушения поведенческих реакций у животных под воздействием специфического агента – JWH-250, действующего на эндоканнабиноидные рецепторы.

JWH-250 – синтетический каннабиноид из семейства фенилацетилиндолов. В отличие от многих ранее синтезированных соединений ряда JWH, у этого вещества нет нафталинового кольца; занимающая это положение 2’-метоксифенилацетильная группа делает JWH-250 представителем нового класса лигандов-каннабиноидов. Психоактивный эффект, при воздействии на человека, возникает гораздо быстрее, чем при употреблении марихуаны. Типичные побочные эффекты – сухость во рту, покраснение белков глаз, повышение артериального давления, учащённое сердцебиение, тошнота при передозировке, обезболивающее действие. JWH-250 воздействует на оба типа каннабиноиднх рецепторов – СВ1 и СВ2, принадлежащих к относительно недавно открытой эндоканнабиноидной сигнальной системе.

Рецепторы CB1 относятся к семейству G-протеинсвязанных рецепторов и широко представлены в областях головного мозга, функции которых связаны с контролем двигательной деятельности, когнитивными функциями, эмоциональными реакциями, мотивированным поведением и гомеостазом. CB1-рецепторы участвуют в реализации таких психических функций, как восприятие, общая активность, двигательная активность, координация движений, витальные функции (голод, половое влечение и пр.), болевая чувствительность, память и эмоции.

Рецепторы CB2 расположены преимущественно в иммунных клетках как внутри, так и вне центральной нервной системы. Функционирование этих рецепторов включает модуляцию эмиссии цитокинов и миграций иммунных клеткок. В мозге рецепторы CB2 представлены в микроглии, кровеносных сосудах, и некоторых нейрона.

Понимание и описание функций эндоканнабиноидной системы в настоящее время далеко от завершения, однако есть мнение, что эндоканнабиноидная система – это система восстановления после перенесенного стресса, обычно находящаяся в «немом» состоянии. Она временно активируется для того, чтобы, помочь человеку вернуть в исходное состояние гомеостаз организма.

Нами применялся JWH-250, полученный двумя путями: в опыте с преэкспозицией JWH-250 был получен в виде спиртового смыва с листьев курительной смеси, перекристаллизован и проанализирован на газовом хромато-масс-спектрометре, в результате чего была идентифицирована его химическая структура. Водное извлечение для введения было приготовлено непосредственно перед проведением экспериментов, руководствуясь правилами о межвидовом переносе доз, изложенным в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под ред. Р.У. Хабриева [3]. Объём введения раствора линейно соответствовал требуемой дозе. В опыте без преэкспозиции исходной субстанцией была пластическая масса, из которой готовили раствор для введения.

В ходе проведенного исследования выяснено, что однократное введение JWH-250 белым беспородным лабораторным мышам в дозах, эквивалентных применяемым людьми для достижения изменённых состояний сознания, обуславливает существенные изменения в структуре модельного поведенческого стрессового ответа, снижая эффективность адаптации животных в условиях изменившейся среды. Выявлены также доза-зависимые эффекты в распределении вероятностей мгновенных скоростей у экспонированных животных в расширенном тесте «Открытое поле» и при анализе спонтанной двигательной активности одиночных животных.

Самцы белых беспородных мышей возрастом 6-7 недель, весом 1922 грамма, содержались в виварии РИЦ «Фарматест» ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России. Животные были выращены в условиях естественных суточных условий освещения, и во время изученного циркадного периода искусственный свет также не использовался.

Использовались стандартные условия содержания: в пластмассовые клетки с опилочной подстилкой. Перед опытом животные содержались в клетках по 10 голов, в переделах суточного опыта по одной мыши в клетке, постоянно подвергаясь «стрессу одиночества». Доступ к воде и пище у животных был свободным, за исключением суток экспонирования в камере регистрации спонтанной двигательной активности (СДА), когда у животных был доступ только к воде. В целом, условия опыта соответствовали требованиям содержания животных в вивариях.

Влияние JWH-250 на стрессовый ответ у животных было изучено в следующих группах опытов в зависимости от использованного сырья – носителя JWH-250:

1. С получением раствора JWH-250 из исходной субстанции в виде пластичной массы; исследование включало только мониторинг спонтанной двигательной активности (СДА) одиночных животных, т. е. только «продольные» относительно стрелы времени данные. Диапазон доз включал 0 мг/кг (контроль), 3,71 мг/кг, 37,1 мг/кг; эти дозы соответствуют 0, 20 и 200 мг/человека соответственно [3].
2. С получением извлечения JWH-250 из растительного сырья с нанесенным на поверхность листьев веществом. Диапазон доз включал 0 мг/кг (контроль), первая вводимая доза была определена исходя из обычно употребляемого объёма курительной смеси, вторая доза являлась пятикратной к ней, в пересчёте на животных [3]. По каждой дозе были получены «продольные» (по временной оси) данные динамика состояния животных, отражённая кривой спонтанной двигательной активности, и «поперечные» данные, развёрнуто характеризующие стрессовую реакцию животных после получасовой экспозиции JWH-250, полученные на установке «Открытое поле».

В обеих группах опытов было обязательным наличие синхронного контроля – группы, инъецированных плацебо (дистиллятом) одновременно с инъецированием опытных животных. В исследовании, в целом было использовано 48 животных. В это число вошли 2 итерации опыта по 5 животных – при изучении длительной (циркадной) динамики эффекта, оказанного на нормальную стрессовую реакцию животных, и 2 итерации опыта по три (других) животных при проведении теста «Открытое поле» для каждой дозы во второй группе опытов.

Для изучения спонтанной двигательной активности одиночных животных использовалась установка «Активность-2» (ЕНИ ПГУ ПГФА, Пермь, Россия). Установка представляет собой высокочувствительный 16-канальный актографический программно-аппаратный комплекс, регистрирующий в цифровом виде данные о спонтанной двигательной активности животных. В данной работе регистрация производилась в течение одного суточного (циркадного) периода, в декабре 2010 и августе 2011гг.

Условия содержания животных в установке не отличались от нормативных (согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96)), однако на время СДА-теста животные содержались в клетках (регистрирующих камерах) в течение суток, поодиночке, имели свободный доступ к воде, но были лишены питания (были накормлены заранее). Данные, сформированные аппаратной частью, обрабатывались программными модулями комплекса, а также стандартными пакетами математической обработки данных.

В период регистрации спонтанной двигательной активности условия ничем не отличались от таковых для основного стада (те же клетки и стеллажи, одинаковые температурные и световые условия). Вся регистрирующая аппаратура находилась с внешней стороны клеток, чем обеспечивалась неинвазивная регистрация, по сравнению, например, с широко распространёнными методиками регистрации подвижности по схеме «пересечение луча». Тем не менее, все животные в опыте (включая группу с плацебо) подвергались в первую очередь «стрессу смены окружающей среды», поскольку были перемещены в незнакомые камеры, и, во вторую очередь, «стрессу одиночества», поскольку регистрировалась именно индивидуальная двигательная активность, и животные находились в индивидуальных камерах по одному.

Рационально анализировать изменения в структуре поведенческого ответа на основе мультипараметрической оценки животных в условиях основных модельных стрессов, в частности стресса смены окружающей среды. Результаты оказываются достаточно чувствительными к условиям содержания животных непосредственно после экспозиции, а также к моменту выполнения стрессирования. Кроме того, существенным фактором полноты описания эффекта оказывается длина временного окна наблюдений, т. е. диапазон масштабов оценки. В частности, эффект 5-кратной дозы JWH-250 в данном исследовании вышел за пределы суточного интервала наблюдений.

Мы показали, что параметры поведенческих вариаций у контрольной и опытных групп существенно различаются как в продольном временном срезе с течением времени после экспозиции, так и в поперечном срезе по ряду локальных во времени параметров двигательной активности. Модифицирующими эффект факторами оказываются доза, количество животных в экспонируемой единице, и момент предъявления стресса.

Полученные СДА данные позволяют выявить и описать отклонения от нормальной кривой двигательной активности, синхронно полученной по данным с контрольной группы животных. Эти результаты позволили проследить суточную динамику влияния изучаемых веществ на СДА в аспектах длительности и магнитуды (абсолютного значения) эффекта.

Для получения «поперечных» относительно стрелы времени данных использовалась установка «Открытое поле» (НПК Открытая Наука, Москва, Россия). Установка представляет собой круглую площадку диаметром 63см с имеющимися 13 отверстиями в полу и разделенной на 19 равных частей с выделением периферической, промежуточной и центральной зоны поля. Освещенность составляла 90 Лк.

Перед опытом животные проходили получасовое экспонирование в клетках по трое, и в «Открытое поле» животное изымалось из этой группы. Тестируемое животное помещалось в центр площадки хвостом к экспериментатору. При записи этограммы в течение трех минут наблюдения за животными регистрировали следующие показатели: число пересеченных квадратов по периферии, в зоне «2/3» и центре площадки (горизонтальная двигательная активность), число вставаний на задние лапы (вертикальная двигательная активность), количество заглядываний в отверстия (ориентировочно-исследовательская активность), количество фекальных болюсов (эмоциональный фактор), груминг.

Для детализации результатов измерений, в частности, более полного раскрытия информации, заключенной в горизонтальной двигательной активности, параллельно с записью этограммы экспертом, выполнялся видеотрекинг «Открытого поля», т. е. животные в процессе выполнения теста регистрировались на видео, после чего поток видеоданных обрабатывался программной частью комплекса. Таким образом, традиционная этограмма регистрировалась параллельно и независимо от технической надстройки.

Поведение интерпретировалось как стереотипия, если наблюдалось вращение головой, вертячка, сильная атаксия, либо другие аномальные повторяющиеся действия. Поведенческие паттерны, которые наблюдались у нормальных, интактных животных, такие как груминг и гравнинг, не описывались как стереотипия, если не длились более 3 секунд.

Анализ этограмм выполнен с применением непараметрического теста Манна-Уитни с применением программного пакета «Statistica 8», дешифровка данных видеотрекинга выполнена с применением оригинального программного обеспечения.

Проведенные исследования позволили заключить, что JWH 250 обладает длительным и выраженным седативным действием на структуры ЦНС, сопровождающимся выраженным снижением спонтанной двигательной активности в целом у одиночных животных в течение первых суток после создания стресса смены окружающей среды. Этот эффект наблюдался независимо от вида исходных субпродуктов субстанции, содержавшей JWH-250, и обе группы опытов продемонстрировали однотипную дозовую зависимость.

Было выявлено, что изучаемое вещество в пятикратной дозе увеличивает горизонтальную двигательную активность мышей по сравнению с контролем, что сопровождается значительным увеличением частоты выхода на 2/3 и центр поля, и таким образом может свидетельствовать о снижении чувства тревоги и страха под действием вещества. Показатели, характеризующие исследовательскую активность, значительно уменьшились по сравнению с контролем. Суммарная вертикальная двигательная активность оказалась полностью подавленной, и обследование отверстий снизилось более чем в два раза по сравнению с контролем, что может говорить о значительном нарушении поведения животных и подавления исследовательских рефлексов.

При испытании животных было отмечено выполнение животными многократного вращения вокруг своей оси с уменьшением продуктивного горизонтального перемещения, а у отдельных животных при пятикратной дозе – замирание в течение 25 секунд.

При детализации анализа поведенческих изменений по результатам видеотрекинга при экспонировании однократной дозой было выявлено достоверное уменьшение времени общего и активного присутствия в зонах «2/3» и «Центр» со значениями p-величины (вероятности ошибочного отклонения нулевой гипотезы) от 0,08 до 0,02 по критерию MannWhitney. Соответственно, увеличилось время присутствия на периферии, причём время активного присутствия не отличается значимо от контроля, т. е. животные, находясь на периферии, пребывают в состоянии относительной неподвижности, но не каталепсии, поскольку выполняют мелкие движения, в том числе стереотипные (мелкие множественные покачивания головой). При этом экспонирование пятикратной дозой не изменило пространственных предпочтений животных при реализации ориентационно-исследовательского поведения.

В целом, поведенческие изменения, наблюдающиеся у животных под воздействием JWH-250, обладающего высоким сродством к рецепторам эндоканнабиноидной системы, обуславливают многоаспектное снижение эффективности стрессового ответа у животных, в частности приводят к энергетической инфляции стресса и последующих адаптационных процессов. Это происходит вследствие нарушений в ориентировочно-исследовательском поведении, в частности, подавлении когнитивных функций, а также в результате двигательного возбуждения и снижения осторожности. Кроме того, у одиночных животных наблюдаются глубокие и длительные нарушения в циркадном ритме расходования энергии.

Результаты данного исследования являются частью формирующегося реестра поведенческих эффектов новых психоактивных веществ, не включенных в Список I «Список наркотических средств и психотропных веществ, оборот которых в РФ запрещен» Перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в РФ, утвержденного постановлением Правительства № 681 от 30.06.1998 г. Исследования были проведены в форме комплексных судебных химико-фармакологических экспертиз на базе РИЦ «Фарматест» ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России.

Использованные источники

1. Федеральный Закон от 08.01.1998 № 3-ФЗ. О наркотических средствах и психотропных веществах : федер. закон : [принят Гос. Думой 10 декабря 1997 г. : одобрен Советом Федерации 24 декабря 1997 г.]
2. Постановление Правительства РФ № 681 от 30.06.1998 г. «Об утверждении Перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации»
3. Хабриев Р.У. «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» / под ред. Р.У. Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп.. – М. : ОАО Изд. «Медицина». 2005г. – 832 с.