1.5. Проблемы воспроизводимости результатов количественных судебно-гистологических исследований

В настоящее время применение судебно-гистологического исследования при решении многих экспертных задач становится малоэффективным без использования методов количественного анализа, поскольку подкрепление качественной информации морфологического исследования количественными характеристиками в значительной степени повышает точность и объективность экспертных выводов. В этой связи количественный подход представляется наиболее перспективным в аспекте разработки объективных и достоверных диагностических технологий в области судебно-медицинской нейтротравматологии, в частности, посвященных проблеме определения давности НЧМТ с наличием СГ.

При проведении любого количественного морфологического исследования следует четко разграничивать свойства изучаемых морфометрических признаков, которые могут быть: количественными, качественными или порядковыми. Количественные параметры являются основным видом морфометрических показателей, которые можно упорядочивать и над которыми можно производить арифметические операции. Количественные морфометрические параметры подразделяются на абсолютные и относительные, а абсолютные, в свою очередь, - на мерные и счетные [61].

Мерные признаки получают путем измерения различных микрообъектов. В количественной морфологии различают линейные, поверхностные и объемные характеристики микрообъектов. Среди гистометрических показателей давности травматических СГ линейными, например, являются размеры синусоидных капилляров, клеточных элементов и толщина капсулы, поверхностными – площадь, а объемными – объем различных структурных компонентов капсулы или содержимого гематомы.

Счетные признаки получают путем подсчета микрообъектов, обладающих каким-либо свойством, в единице площади или объема. Примерами счетных гистометрических показателей давности СГ служат число различных клеточных популяций, а также количество сосудов в единице площади или объема гистологического среза.

Относительные линейные, поверхностные и объемные показатели характеризуют отношение размеров, площади и объема исследуемых микрообъектов к аналогичным параметрам ткани или органа. В аспекте идентификации давности СГ относительные показатели представляют собой наиболее многочисленную группу критериев, включающую показатели относительного объема клеточного и сосудистого компонентов, гемосидероза капсулы.

Качественные (альтернативные) признаки могут быть измерены только в терминах принадлежности к одному из двух взаимно исключающих классов (наличие или отсутствие). Единственный способ описания качественных признаков состоит в том, чтобы подсчитать число объектов, имеющих одно и то же свойство, и определить, какая доля от общего числа объектов приходится на то или иное свойство. В совокупности морфометрических признаков давности СГ к относительным счетным признакам относятся, в частности, показатели долей различных популяций в клеточном инфильтрате капсулы СГ.

Порядковые признаки позволяют распределить объекты в определенном порядке в зависимости от степени выраженности исследуемого свойства. Указанные признаки можно только упорядочить, производить арифметические действия над ними нельзя. Порядковые признаки лежат в основе полуколичественных оценочных шкал. В настоящее время полуколичественные методы ввиду нечеткости процедуры своего оценивания находят все меньшее применение в патоморфологических исследованиях, вытесняясь более точными количественными морфометрическими показателями.

Разделение морфометрических параметров на вышеперечисленные классы необходимо в связи с неодинаковой их воспроизводимостью из-за влияния на результаты их оценки способов гистологической техники и микроскопического исследования. Воспроизводимость представляет собой важнейшее условие успешности внедрения и использования количественных методов при производстве судебно-гистологических исследований [55].

В широком смысле под воспроизводимостью понимается надежность интерпретации результатов метода, которая оценивается путем сравнения результатов исследования одного и того же объекта разными специалистами [9]. Особенностью количественных морфологических методов является то, что помимо субъективного, имеется ряд дополнительных объективных факторов, отрицательно сказывающихся на воспроизводимости результатов исследования. Наличие указанных факторов объясняется разнородностью способов предварительной обработки объектов исследования и регистрации исследуемых параметров, которыми пользуются разработчики и пользователи количественных морфологических методик.

Весь спектр специфичных для судебно-гистологических исследований факторов, влияющих на воспроизводимость его результатов, можно представить в виде двух групп: а) влияние методики изготовления гистологических срезов; б) влияние вида оптической аппаратуры. Первая группа факторов слагается из влияния усадки тканей и влияния толщины гистологических срезов. Вторая разновидность факторов представлена влиянием площади используемой для оценивания количественного признака оптической тест-системы.

При изготовлении гистологических препаратов исследуемые фрагменты тканей подвергаются усадке, обусловленной воздействием на них процессов фиксации, дегидратации, заливки и окраски. Вследствие этого полученные при измерении в гистологических срезах количественные характеристики микрообъектов в значительной степени могут отличаться от их истинных величин [61]. Данное обстоятельство явилось причиной введения поправок на усадку тканей. Коэффициенты усадки определяются путем измерения изменений объема образцов тканей после выполнения каждого этапа гистологической техники. Если объем обрабатываемого кусочка определить технически сложно, то для расчета коэффициентов усадки используют результаты линейных измерений до и после определенного этапа гистотехнической обработки [61,62]. Поверхностный и объемный коэффициенты усадки легко определяются затем по величине линейного коэффициента путем возведения ее соответственно в квадрат и куб.

Введение поправок на усадку тканей необходимо при работе с абсолютными (мерными и, особенно, счетными) морфометрическими показателями. При отсутствии данных о коэффициентах усадки невозможно сопоставление результатов морфометрии, полученных разными исследователями и, что особенно важно, использование разработанных количественных методов в практических целях при проведении судебно-медицинских экспертных исследований.

Для сопоставления результатов морфометрии, полученных с использованием гистологических методов с разными коэффициентами усадки, достаточно приводить истинные количественные характеристики микрообъектов, вычисляемые с помощью формул:
\[L = l \cdot {k_L};\]
\[S = s \cdot {k_S} = s \cdot k_L^2;\]
\[V = v \cdot {k_V} = v \cdot k_L^3,\]
где L, S, V – истинные линейные поверхностные и объемные гистометрические показатели соответственно; l, s, v – аналогичные показатели без учета усадки; k_L, k_S, k_V - линейный, поверхностный и объемный коэффициенты усадки соответственно [61,62].

Приведенные формулы показывают, что в наибольшей степени усадка влияет на объемные и поверхностные показатели и менее всего – на линейные.

Сложнее обстоит дело со счетными показателями. В зависимости от размеров изучаемых микрообъектов сравнение должно осуществляться одним из двух указанных ниже способов.

Если толщина среза пренебрежимо мала по сравнению с размерами изучаемых микрообъектов, то гистологический срез можно условно принять за плоскость. В этом случае сопоставление производится с помощью определения истинного количества профилей микрообъектов в единице площади ткани:
\[N = n/{k_S} = n/k_L^2,\]
где N – истинная численная плотность профилей микрообъектов; n - численная плотность профилей микрообъектов без учета усадки [62]. Указанный способ коррекции результатов гистометрии правомочно использовать, например, при определении количества синусоидных капилляров в единице площади среза капсулы СГ.

Если размеры микрообъектов меньше или сопоставимы с толщиной гистологического среза, величина последней значительно влияет на их количество в тестовой площади, поскольку в срез попадают фрагменты микрообъектов из разных слоев ткани [62]. Вследствие этого количество профилей микрообъектов, регистрируемых в одной и той же площади среза, положительно коррелирует с толщиной среза. Поэтому на клеточном уровне изучения определение истинного количества профилей фрагментов микрообъектов в тестовой площади ткани определенной толщины должно производиться иначе:
\[N = n/{k_V} = n/k_L^3.\]
Использование данного способа устранения влияния усадки показано при разработке способов идентификации давности СГ, основанных на счетных гистометрических признаках.

Отсюда толщина среза искажает только счетные гистометрические показатели, регистрируемые на клеточном уровне, в связи с чем при их изучении требуется введение соответствующей поправки:
\[{n_T} = {t_T} \cdot {n_i}/{t_i},\]
где n_T - число микрообъектов в срезе стандартной толщины; t_T - стандартная толщина среза; n_i - число микрообъектов в использованном срезе; t_i - толщина использованного среза.

Площадь использованной тест-системы влияет на воспроизводимость результатов исследования любых счетных количественных показателей. Поэтому для сравнения количественных данных, полученных разными исследователями, необходимо указывать площадь тест-системы, в пределах которой производилось определение счетных показателей.

В настоящее время следует считать неприемлемым использование счетных показателей без точного указания площади тест-системы, в пределах которой осуществлялся подсчет. Это также относится к случаям, когда указывается только общее увеличение оптической системы, поскольку площадь поля зрения при одинаковых увеличениях одного и того же микроскопа в зависимости от типа используемых окуляров может быть разной.

При сравнении результатов исследования, полученных с использованием тестовых оптических систем разной площади, требуется адаптация численной плотности микрообъектов в площади использованной тестовой системы к стандартной площади по формуле:
\[{n_T} = {n_i} \cdot {S_T}/{S_i},\]
где n_T - число микрообъектов в срезе стандартной площади; S_T - стандартная площадь тест-системы; n_i - число микрообъектов в использованной тестовой площади; S_i - использованная тестовая площадь.

В отличие от абсолютных количественных показателей на относительные количественные и качественные показатели не влияют ни усадка тканей, ни толщина срезов, ни площадь используемых оптических тест-систем. Степень влияния на воспроизводимость гистологического исследования вида использованных морфометрических показателей приведена в таблице 4.

Таким образом, при разработке способов количественной морфологической идентификации давности СГ необходимо учитывать влияние всех факторов на воспроизводимость результатов разрабатываемых методик. Данное обстоятельство предъявляет такое жесткое требование к организации гистологического исследования, как обеспечение стандартизации всех этапов изготовления и изучения гистологических препаратов, включая забор фрагментов органов и тканей, их фиксацию, изготовление и микроскопию срезов. Стандартизация изготовления гистологических препаратов должна включать не только стандарты набора реактивов и времени контакта с ними, но и стандарты размеров забираемых образцов и толщины срезов.

Ввиду существующей организационной разобщенности макроскопического и микроскопического этапов исследований в учреждениях судебно-медицинской экспертизы РФ, определение давности СГ по абсолютным и счетным гистометрическим признакам, как и любое иное полноценное количественное гистологическое исследование невозможно без преемственности в работе структурных судебно-медицинских подразделений.
Таблица 4 Воспроизводимость количественного гистологического исследования в зависимости от вида морфометрических показателей

Для использования указанных гистометрических показателей в целях определения давности СГ судебно-медицинский эксперт - танатолог обязан обеспечивать стандартизацию забора и фиксации объектов, поскольку погрешности, допущенные на этом этапе, являются самыми значительными в ходе всего количественного гистологического исследования и не могут быть нивелированы строгим соблюдением технологического процесса на других его этапах. При отсутствии подобного контроля внедрению в практику подлежат только методы, основанные на использовании качественных и относительных количественных морфометрических показателей.

Поэтому разработка способов количественной морфологической идентификации давности СГ может основываться только на использовании гистостереометрических, относительных счетных и линейных гистометрических показателей. Правомочность применения последнего вида показателей подтверждается следующими рассмотрениями.

Пусть L – истинный размер микрообъекта какой-либо ткани. Допустим, что из данной ткани двумя различными гистотехническими методами с линейными коэффициентами усадки k₁ и k₂ были приготовлены два гистологических среза. Тогда искомый размер микрообъекта в указанных срезах будет равен
\[{l_1} = \frac{L}{{{k_1}}}.\]
и
\[{l_2} = \frac{L}{{{k_2}}}.\]
Отсюда абсолютная разность размеров l₁ и l₂ составляет
\[\left| {\Delta l} \right| = \left| {\frac{L}{{{k_1}}} - \frac{L}{{{k_2}}}} \right| = \left| {\frac{{L\Delta k}}{{{k_1}{k_2}}}} \right|.\]
Полученная формула показывает, что абсолютная разность прямо пропорциональна истинной величине микрообъекта L, а также разности линейных коэффициентов усадки Δk и обратно пропорциональна величинам линейных коэффициентов усадки k₁ и k₂.
Разность Δl можно выразить также и через отношение размеров l₁ и l₂:
\[\frac{{{l_1}}}{{{l_2}}} = \frac{L}{{{k_1}}} \cdot \frac{{{k_2}}}{L} = \frac{{{k_2}}}{{{k_1}}},\]
из которого следует, что
\[{l_2} = {l_1}\frac{{{k_1}}}{{{k_2}}}\]
и
\[\Delta l = {l_1}\left( {1 - \frac{{{k_1}}}{{{k_2}}}} \right) .\]
Из последней формулы следует
\[\frac{{\Delta l}}{{{l_1}}} = 1 - \frac{{{k_1}}}{{{k_2}}}.\]
Рассмотрим отношение коэффициентов усадки k₁/k₂. В общем смысле на него оказывают влияние характер исследуемой ткани, способы фиксации трупного материала, приготовления и окрашивания гистологических препаратов.

При создании конкретной количественной гистологической методики имеет место однотипность исследуемых тканей. Если при этом стандартизировать гистологическую технику путем указания методики фиксации объектов, приготовления и окрашивания срезов, то отношение коэффициентов усадки будет стремиться к своему пределу, равному единице.

Отсюда
\[\mathop {\lim }\limits_{\frac{{{k_1}}}{{{k_2}}} \to 1} \Delta l = 0\]
и \[\mathop {\lim }\limits_{\frac{{{k_1}}}{{{k_2}}} \to 1} {l_2} = {l_1}.\]
В условиях стандартизации приготовления гистологических срезов \[{k_1}/{k_2} \approx 1,\]
поэтому \[{l_1} \approx {l_2}\]
и \[\Delta l \approx 0.\]
Заметим также, что для абсолютных поверхностных и объемных морфометрических показателей имеют место отношения:
\[\Delta s = {s_1}\left( {1 - \frac{{k_1^2}}{{k_2^2}}} \right)\]
и \[\Delta v = {v_1}\left( {1 - \frac{{k_1^3}}{{k_2^3}}} \right) ,\]
где Δs и Δv - соответственно разности абсолютных поверхностных s₁ - s₂ и объемных v₁ - v₂ морфометрических показателей.

Поэтому Δs→0 и Δv→0 выполняются только при соблюдении практически невыполнимых условий
\[\frac{{k_1^2}}{{k_2^2}} \to 1\]
и
\[\frac{{k_1^3}}{{k_2^3}} \to 1\]
соответственно.

Полученные формулы эквивалентны выражениям
\[{l_1} \to {l_2}\] при \[{k_1} \to {k_2},\]
\[{s_1} \to {s_2}\] при \[k_1^2 \to k_2^2,\]
\[{v_1} \to {v_2}\] при \[k_1^3 \to k_2^3.\]
Аналогично для счетных признаков на тканевом уровне верно
\[{n_1} \to {n_2}\] при \[k_1^2 \to k_2^2,\]
а на клеточном –
\[{n_1} \to {n_2}\] при \[k_1^3 \to k_2^3.\]
Кроме этого для счетных признаков, независимо от уровня их регистрации, необходима еще коррекция используемых тестовых оптических систем, а для счетных признаков, регистрируемых на клеточном уровне, - также и коррекция толщины гистологических срезов. Если коррекция площадей тестовых систем практически выполнима, хотя и несколько увеличивает трудоемкость морфометрии, то контроль толщины срезов пока сильно затруднен или даже невозможен.

Читать далее раздел "2.1. Функциональная морфология оболочек головного мозга"⇒