Судебно-химическое определение тропикамида

Publication in electronic media: 30.03.2012 under http://journal.forens-lit.ru/node/666
Publication in print media: Вопросы судебной медицины, медицинского права и биоэтики - Самара 2011

Е.П. Панова, О.В. Владимирова, М.И. Куриленко, Л.П. Дряглина

ГУЗ «Самарское областное бюро судебно-медицинской экспертизы»

В последнее время среди наркоманов, употребляющих аптечные препараты, в качестве наркотических средств стал очень популярен новый «аптечный» наркотик – тропикамид (Tropicamide). Химическое название: N – этил – альфа – (гидроксиметил) – N – (4 – пиридинилметил) бензолацетамид. Его синоним – бистропамид (Bistropamide). Другие его названия: Diotrope; Mydral; Mydramide; Mydriacil; Mydriacyl; Mydrian; Mydriaticum; Mydrum; Myriacyl; Ocu-Tropic; Opticyl; Tropicacyl; Tropicil Top; Tropicol; Trohimil; Visumidriatic. Латинское название – Tropicamide. Брутто формула – С17Н20N 2О2.. Молекулярная масса - 284,4. Т пл. = 96 - 97°С; рКа - 5,2; Log P (октанол/вода) – 1,2.[8]. Тропикамид относится к третичным аминам. Тропикамид представляет собой белый кристаллический порошок. Тропикамид трудно растворим в воде (1:160), легко растворим в этаноле (1:3,5). Очень хорошо растворим в хлороформе (1:2).

Препарат предназначен для диагностических целей при проведении офтальмоскопии и определения рефракции, для профилактики развития синехий в комплексной терапии воспалительных заболеваний глаз. Препарат очень доступен. В аптеке его можно купить без рецепта. Тропикамид по фармакологическому действию относится к М-холиноблокирующим средствам. Он блокирует рецепторы сфинктера радужки и цилиарной мышцы, вызывая кратковременный мидриаз и паралич аккомодации. Незначительно повышает внутриглазное давление. Фармакокинетика: процент всасывания активного вещества, поступающего через слёзные каналы в нос, относительно высокий (возможны побочные эффекты, обусловленные системным действием). Препарат вызывает сильнейшее привыкание и невероятную психическую зависимость; регулярные инъекции приводят к тяжёлым последствиям в очень короткие сроки. Тропикамид вызывает галлюцинации. Зависимость и последствия использования тропикамида во много раз сильнее героина. У наркоманов, употребляющих препарат, кожа в течение считанных недель становится цвета жёлтого воска, гемоглобин падает до 32 г/л.

В нашей практике за период с января по август 2010 г тропикамид был обнаружен в 24 случаях. Причём чаще всего в сочетании с другими наркотическими веществами, в основном из группы опия: в сочетании с морфином - в 19 случаях, с кодеином – в 12, с дезоморфином – в 9, рацеморфаном – в 3, с трамалом – в 1 случае.

Сведений в литературе о методиках изолирования тропикамида из трупного материала, качественного определения некоторыми химическими реактивами, используемые в нашей судебно-химической лаборатории, а также количественного определения с помощью спектрофотометрии и ГХМС нами не встретилось.

Целями проведения данной работы являлись: 1) определение оптимальных условий для извлечения тропикамида из трупного материала; 2) качественное и количественное определение его, используя доступные химические реагенты, различные химические и физико-химические методы исследования.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Изучались оптимальные условия для экстракции тропикамида из водных растворов и разнообразных биологических объектов.
2. Подбирались наиболее подходящие системы растворителей, химические реактивы для его детектирования и пластины для ТСХ разных фирм-производителей, используемые в нашей лаборатории, при проведении тонкослойной хроматографии.
3. Подбирались оптимальные условия для дериватизации тропикамида при проведении газовой хроматографии.
4. Разрабатывалось количественное определение тропикамида спектрофотометрическим методом на спектрофотометрах фирмы Shimadzu UV-1700 и UV-mini 1240.
5. Разрабатывалось качественное и количественное определение тропикамида с помощью хромато-масс-спектрометрии.

В качестве стандартного вещества для исследования использовали глазные капли 1% раствора тропикамида производства К.О. Румфарм Компании С.Р.Д. (Румыния).

Экстракция тропикамида из водных растворов и биологических объектов

Так как тропикамид – слабое основание (величина РКа =5,2), он экстрагируется из водных растворов и разнообразных биологических объектов органическими растворителями, главным образом при РН = 7-8 (РН= РКа =±2). В качестве экстрагентов использовали хлороформ, так как тропикамид хорошо растворим в нём (1:2). Растворимость тропикамида в эфире в литературных источниках не указана. Поэтому извлечение тропикамида из водных растворов и разнообразных биологических объектов при РН=2 (при подкислении раствором щавелевой или хлористоводородной кислоты) и РН=7-8 (при подщелачивании 25 % раствором аммиака) проводили хлороформом.

Провели экспериментально определение степени экстракции хлороформом тропикамида из водных растворов и разнообразных биологических объектов (после предварительной затравки определённым количеством тропикамида) хлороформом при РН=2 и РН=7-8, а также после проведения кислотного гидролиза при этих же значениях РН.

Количественное определение тропикамида после экстракции проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре фирмы Shimadzu UV 1700 (двулучевом).

Основное количество тропикамида извлекалось хлороформом при РН=7-8 - около 88 % из водных растворов. При РН=2,0 хлороформом извлекается около 6 %. Из биологических объектов наибольшее количество тропикамида извлекается также при значении РН=7-8 после их предварительного кислотного гидролиза.

На основании, проведённого исследования, можно рекомендовать вышеприведённую методику извлечения тропикамида (пробоподготовку) из водных растворов и разнообразных биологических объектов. При этом при извлечении из кислых растворов необходимо использовать вместо эфира хлороформ. Основное извлечение тропикамида целесообразно проводить при значении РН=7-8.

Пробоподготовка

1.Экстракция по общему ходу исследования:

50 г (25 г) мелкоизмельчённого объекта заливали дистиллированной водой, подкисляли 10 % раствором щавелевой кислоты (или хлористоводородной) до РН=2,0; настаивали в течение 15 минут при 3000 об/мин. Объект вторично настаивали при тех же условиях в течение часа. Операцию отделения водной фазы повторяли. Полученные водные извлечения объединяли, насыщали сернокислым аммонием и фильтровали через складчатый фильтр. Водные извлечения подкисляли до РН=2,0 и экстрагировали хлороформом трижды порциями по 25 мл(15 мл) каждая в течение 3 минут. Объединённые хлороформные извлечения фильтровали через сухой складчатый фильтр с 5 г безводного сульфата натрия в мерную колбу на 50 мл (25 мл). Затем проводили исследование кислого извлечения. Кислый центрифугат подщелочили 25 % раствором аммиака до РН=7-8 и 3 раза извлекли хлороформом по 25 мл (15 мл). Хлороформные извлечения объединяли, фильтровали через слой безводного сульфата натрия в мерную колбу на 50 мл (25 мл). Далее проводили исследование щелочного извлечения на тропикамид.

2. Экстракция после кислотного гидролиза:

25 г мелкоизмельчённого объекта помещали в колбу, добавляли 2,5 мл концентрированной соляной кислоты, 10 мл дистиллированной воды. Подвергали нагреванию на песчаной или глицериновой бане при температуре 110°С в течение 40 минут. После охлаждения гидролизат фильтровали через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой, и промывали фильтр 2-3 мл дистиллированной воды. Проводили экстракционную очистку хлороформом 3 раза порциями по 30 мл. Очищенную вытяжку подщелачивали натрия гидрокарбонатом до РН=7-8. Добавление соли проводили порциями, не допуская сильного вспенивания. Затем проводили экстракцию хлороформом при РН=7-8 порциями по 30 мл. Органические вытяжки объединяли, центрифугировали, фильтровали через слой безводного сульфата натрия. Доводили хлороформом в мерной колбе на 50 мл. Далее проводили исследование на тропикамид.

3. Экстракция из крови:

К 50 (25) мл крови прибавляли 2 М раствор хлористоводородной кислоты до РН=2,0 и дважды экстрагировали хлороформом порциями по 50 (25) мл в течение 10 минут. Хлороформные экстракты объединяли, фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Выпаривали до сухого остатка (экстракт1), либо доводили в мерной колбе до требуемого объёма. К водной фазе прибавляли 25 % раствор аммиака до РН=7-8 и дважды экстрагировали хлороформом порциями по 50 (25) мл. Органические экстракты объединяли, фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия в мерную колбу до требуемого объёма, либо испаряли в токе тёплого воздуха (экстракт 2).

Качественный анализ тропикамида химическими и физико-химическими методами

1. Тонкослойная хроматография тропикамида

Реагенты и оборудование в ТСХ: При проведении качественного исследования тропикамида использовали пластины с металлической и пластиковой подложкой различных фирм-производителей. Применяли пластинки размером 5 х 10 см. Хроматографирование проводили в герметически закрытых камерах с использованием восходящего элюирования хроматографической системы различных растворителей. Перед началом проведения разделения пластину размечали следующим образом: отмечали линию старта и фронта растворителя, зоны хроматографирования исследуемых веществ и стандартного раствора. Анализируемые растворы осторожно, чтобы не повредить поверхность слоя адсорбента, наносили на пластинку с использованием микрошприца на 10 мкл (“Hamilton 701”). При приготовлении испытуемого раствора 0.5 мл 1 % раствора (точная навеска) тропикамида развели в небольшом количестве дистиллированной воды и извлекали с учётом РКа (5,2) при РН = 2,0 и РН = 8,0 и хорошей растворимости в хлороформе (1:2) хлороформом 3 раза по 5 мл. Полученные хлороформные извлечения помещали в мерную колбу на 10 мл и доводили объём до метки. В 10 мл такого раствора содержалось 0,005 г тропикамида. В 1 мл – 500 мкг тропикамида. В 1 мкл – 0,5 мкг тропикамида. Системы растворителей смешивали в требуемых соотношениях непосредственно перед использованием при помощи интенсивного перемешивания. Приготовленные растворы заливали в камеры, которые герметически закрывали крышками, и оставляли на 0.5 – 1 час для установления равновесия. [6]

Проверка чувствительности применяемых реактивов

Наносили 1, 3, 5, 6,7,8,9,10 мкл (в 1 мкл – 0,5 мкг) исследуемого раствора тропикамида. Использовали пластины sorbfil на ПЭТФ (тип сорбента – силикагель СТХ-1А; зернение – 5-17 мкм; толщина слоя – 110 мкм; связующее - силиказоль) и sorbfil на алюминиевой подложке (тип сорбента – силикагель СТХ-1ВЭ; зернение – 8-12 мкм; толщина слоя – 100 мкм; связующее – силиказоль и silufol на алюминиевой подложке (сорбент: silpearl – широкопористый силикагель по Питри с люминисцентным индикатором для УФ 254 нм). Результаты проверки чувствительности применяемых реактивов приведены в таблице 1.

Также детектирование тропикамида на пластинах проводили при помощи УФ облучения (254 нм) и при 365 нм. На пластинах наблюдалось поглощение пятнами тропикамида в области 365 нм.

Таблица 1 Чувствительность различных реактивов к тропикамиду

Качественный анализ

На предварительно подготовленные пластины наносили определённый объём (с концентрацией тропикамида в пределах чувствительности используемых реагентов) приготовленного хлороформного раствора тропикамида.

Основной качественной характеристикой вещества в тонкослойной хроматографии является значение Rf, расчёт которого проводят по формуле:

Rf=Lx/Ls, где Lx – длина пробега центра хроматографической зоны исследуемого соединения; Ls – длина пробега фронта растворителя.

Результаты ТСХ - исследование тропикамида по выше описанной методике в различных системах на разных пластинах приведены в табл. 2

Таблица 2 Значения Rf тропикамида в различных ПФ на пластинах различных фирм – производителей

2. Спектрофотометрия тропикамида в УФ – области.

Качественный анализ тропикамида спектральным методом.

Проводили исследование спектральных характеристик тропикамида в УФ-области на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 (однолучевом) и на спектрофотометре Shimadzu UV 1700 (двулучевом).

В УФ-спектрах растворов тропикамида в 0,1 Н растворе соляной кислоты наблюдали один максимум поглощения при длине волны 254 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 и при длине волны 253,8 нм – 254 нм на спектрофотометре Shimadzu UV 1700, в зависимости от концентрации препарата.

В УФ-спектрах растворов тропикамида в щелочной среде наблюдали один максимум поглощения при длине волны 256 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 и на спектрофотометре Shimadzu UV 1700.

В УФ-спектрах растворов тропикамида в нейтральной среде наблюдали один максимум поглощения при длине волны 255 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 и на спектрофотометре Shimadzu UV 1700.

Количественный анализ тропикамида спектральным методом.

Метод УФ-спектрофотометрии использовали для количественного определения тропикамида.

УФ – спектры растворов тропикамида в 0,1 Н растворе соляной кислоты снимали на спектрофотометре Shimadzu UV 1700 (двулучевом). Оптическую плотность исследуемых растворов снимали при длине волны 254 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 0,1 Н раствор соляной кислоты. [7]

Закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в интервале концентраций 10-100 мкг/мл. Коэффициент корреляции составляет 0,998752.

Исследование спектрофотометрическим методом из биологических объектов проводили после предварительной очистки щелочного хлороформного извлечения с помощью тонкослойной хроматографии в системе - этилацетат : метанол : аммиак (25%) – 85 : 10 : 5.

По калибровочному графику определяли концентрацию раствора и по формуле рассчитывали количество тропикамида в мг на 1000 г объекта:

$X = \frac{{{C_1} \cdot {V_1} \cdot {V_2} \cdot 1000}}{{P \cdot {V_2} \cdot 1000}}$

где X – количество тропикамида в 1000 г объекта, мг; C₁– концентрация тропикамида, найденная по калибровочному графику, по оптической плотности тропикамида; V₁– объём щелочного извлечения из объекта, мл; V₂– объём щелочного извлечения, взятого для количественного определения, мл; V₂ – объём элюата, мл; P – навеска объекта, г.

3. Газохроматографическое исследование тропикамида.

Исследование проводили на газовом хроматографе « Кристалл 2000М» с пламенно-ионизационным детектором, на кварцевой капиллярной колонке 30м х 0,25 мм (привитая фаза TR-1MS). Температура термостата колонки 250°С, температура испарителя 280°С, температура детектора 280°С. Скорость потока газа-носителя азота, проходящего через колонку 1 мл/мин, водорода 20 мл/мин, воздуха 200 мл/мин. Объёмы вводимых в испаритель проб – 1 мкл. Пробы предварительно дериватизировали BSA. Дериватизацию проводили 30 мкл BSA в герметично закрытой ёмкости с резиново-тефлоновой мембраной, которую выдерживали 5 минут при температуре 60° С. После охлаждения до комнатной температуры проводили исследование. На хроматограмме отмечали пик с абсолютным временем удерживания 6 минут 48 секунд.

При данных условиях одновременно определялись: рацеморфан (5 мин. 22 сек.), дезоморфин (6 мин. 10 сек.), кодеин (8 мин.18 сек.), морфин (9 мин.20 сек.).

4. Хромато-масс спектрометрическое исследование тропикамида.

Обнаружение тропикамида осуществлялось по времени удерживания и характерному масс-спектру, снятому в режиме полного сканирования ионов m/z (SCAN) в интервале масс 45-550 а.е.м. Исследование проводили на газожидкостном хроматографе Focus GS фирмы Thermo Electron Corporation. Условия ГХ/МС исследования: капиллярная колонка Thermo TR – 1 MS 30x0,25 mm ID x 0,25 um film. Скорость газа-носителя 1,0 мл в минуту. Деление потока 1:30. Начальное давление на колонке 70. Температура испарителя 270°С, температура переходной линии 250°С. Напряжение на умножителе 1113 V. Задержка на выход растворителя 4 минуты. Начальная температура колонки 130оС, режим программирования 23°С в минуту до 250°С, 5 минут при 280°С. Режим сканирования от 30-550 m/z.

Масс-спектральная характеристика тропикамида - 92; 91;65; 103; 93; 39; 163; 77. Время удерживания 9,48 мин.

Пробоподготовка крови и мочи для хромато-масс-спектрометрического исследовании.

К 2 мл (5 мл) крови, мочи добавляли 2 мл (5 мл) ацетатного буфера с РН=4,18 и 8 мл (16 мл) хлороформа (или метиленхлорида). Содержимое встряхивали 5 минут и центрифугировали при 4000 об/мин. Органический слой отделяли и фильтровали через безводный сульфат натрия во флакон. Органическую фазу выпаривали досуха в конической пробирке в токе воздуха при 40°С, добавляли 80 мкл метанола и 1 мкл полученного раствора исследовали методом ГХ/МС на вещества кислого и слабоосновного характера. К остатку после отделения органического слоя, добавляли 2 мл(5 мл) фосфатного буфера с РН=8,8 и 8 мл (16 мл) хлороформа (или метиленхлорида). Содержимое встряхивали 5 минут и центрифугировали при 4000 об/мин. Органический слой отделяли и фильтровали через безводный сульфат натрия во флакон. Органическую фазу выпаривали досуха в конической пробирке в токе воздуха при 40° С, добавляли 50 мкл метанола и 1 мкл полученного раствора исследовали методом ГХ/МС на вещества основного характера.

Качественный анализ тропикамид.

Сухой остаток из водного раствора глазных капель тропикамида реконструировали в 100 мкл метанола, 1 мкл извлечения вводили в инжектор газожидкостного хроматографа, сопряжённого с масс-селективным детектором DSQ. При этом на хроматограмме фиксировали пики с временами удерживания (мин). Масс-спектры, снятые с вершин данных хроматографических пиков (m/z), сравнивали с масс-спектрами библиотеки Nist, с определённой долей вероятности (%), что позволило произвести их идентификацию.

Количественное определение.

Для количественного определения тропикамида на газовом хроматографе с МС-детектором использовали режим селективного ионного мониторинга – SIM, проводили детектирование выбранных ионов m/z. По наиболее интенсивному иону (target) 92 а.е.м. проводили количественную градуировку, ионы 91;65; 103; 93; 39; 163; 77 а.е.м. использовали для дополнительной идентификации и определения точности калибровки.

Построение градуировочного графика проводили по усреднённым данным трёх измерений методом абсолютной калибровки с использованием метанольных растворов тропикамида в диапазоне концентраций 100-1000 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9736.

Выводы

1. Максимальное извлечение тропикамида проводить при РН=7-8 с учётом его хорошей растворимости в хлороформе.
2. Для разделения тропикамида использовать следующие системы растворителей: этилацетат : метанол : аммиак (25 %) – 85 : 10 : 5; метанол : аммиак (25%) – 100 : 1.5; хлороформ : метанол – 90:10 с использованием всех типов пластин.
3. Детектирование тропикамида проводить в области 365 нм. Проявлять хроматографические зоны на пластинах подкисленным раствором йодплатината и реактивом Драгендорфа модифицированным (по Мунье).
4. При использовании в качестве проявителя реактив Либермана следует применять пластины sorbfil на ПЭТФ и силикагель на стеклянной подложке.
5. Для качественного обнаружения тропикамида использовать экспрессный, легко доступный и чувствительный метод ТСХ; спектрофотометрирование в УФ – области кислого и щелочного растворов; газовую хроматографию с применением дериватизации BSA и хромато-масс-спектрометрию.
6. Для количественного анализа тропикамида использовать спектрофотометрический метод в УФ – области растворов в 0,1 Н растворе соляной кислоты при длине волны 254 нм и метод хромато-масс-спектрометрии.

Библиографический список

1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник.-М.:АстрафармСервис, 2004 - С.862.
2. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. М.:7-е издание, 2000. – С.941.
3. Изотов Б.Н., Ерёмин С.К. Курс лекций по новым методам судебно-химического токсикологического анализа. – М.: Медицинский институт им. И.М. Сеченова. – 1996г., 1999г. – 135с.
4. Изотов Б.Н., Ерёмин С.К., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств / Б.Н. Изотов. – М.: Мысль. – 1993. – 260с.
5. Химико-токсикологический анализ веществ, вызывающих одурманивание. Методические указания. М.- 1989. – С.8-34.
6. Избранные лекции по токсикологической химии. - Учебное пособие для студентов очного и заочного факультетов, факультета иностранных граждан и практических работников. П.: Пермская государственная фармацевтическая академия. – 2005. – 152 с.
7. Clarke,s Analysis of Drags and Poisons, London: Pharmaceutical Press. Electronic version, 2004. – C.1041.
8. Метью Дж. Элленхорн. Медицинская токсикология: Диагностика и лечение отравлений у человека в 2 т./пер. с англ. М.: Медицина, 2003. – т.1 С.400-406.