К вопросу о дифференцированном подходе к получению высокомолекулярной ДНК из объектов биологической природы

Publication in electronic media: 12.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/493
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2011 Вып. 17

С.Г. Хайдаршин, Г.В. Червоная

г. Барнаул

В последние годы в связи с изменением политической, социально экономической и криминогенной ситуации отмечается значительный рост числа тяжких преступлений, в том числе против жизни, здоровья и достоинства граждан. Увеличилось число заказных и циничных убийств, половых преступлений. Все чаще объектом судебно-генетической экспертизы становятся трупы неизвестных лиц, порой в состоянии выраженной гнилостной трансформации, обугливания, расчленения, скелетирования и т.д. Структурой обладающей индивидуальной специфичностью в организме, является ДНК. Предложенный Джеффрисом в 1985 г. метод геномной «дактилоскопии» дал принципиально новые возможности идентификации личности, принадлежности биологических объектов, определения спорного отцовства, материнства и замены детей на уровне анализа вариабельности структуры ДНК. В настоящее время исходным методом, наиболее чувствительным и специфичным для оценки профилей ДНК, является анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК, основанный на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Теоретически метод ПЦР позволяет проводить анализ нужного локуса ДНК, даже если его концентрация в пробирке составляет всего 1,66.10^-24 М (т.е., одна молекула).

Исследование состоит из следующих этапов: выделение ДНК из объектов, амплификация (увеличение количества копий) и детекция с последующим анализом гипервариабельных участков ДНК, которые строго специфичны для каждого индивидуума и могут служить индивидуализирующими личность признаками.

Высокая чувствительность ПЦР-анализа выдвигает жесткие требования к правилам выделения ДНК из биологического материала, поэтому большое внимание следует уделять методам экстракции и очистки ДНК. Необходимо индивидуально подбирать соответствующую методику в зависимости от вида объекта, его состояния и вида ткани. Для использования ДНК в идентификационных целях необходимо, прежде всего, получить ее в чистом виде, свободном от нуклеаз и сопутствующих примесей (белков, железосодержащих соединений и т.д.). ПЦР-методы базируются на образовании специфического продукта (амплификона) ферментом ДНК-полимеразой на специфичной ДНК-матрице in vitro. Поэтому ДНК-матрица должна быть доступна для работы полимеразы (свободна от белков), не должна быть повреждена и в реакционной среде не должны присутствовать ингибиторы реакции.

В эукариотических клетках ядерная ДНК ассоциирована с положительно заряженными белками – гистонами, образуя стабильный хроматин. Однако ДНК в виде хроматина может легко «ломаться» с образованием более мелких фрагментов при обычных манипуляциях или в течение очистки ее от гистонов. Это связано с тем, что длина одной молекулы ДНК из диплоидной клетки человека составляет примерно 2 м, в то время как ее диаметр – около 2 нм. Таким образом, простое перемешивание или даже неосторожный отбор пипеткой раствора ДНК приводит к существенному уменьшению ее молекулярной массы и, что самое важное, падению титра матрицы, пригодной для ДНК-типирования. Кроме того, ДНК может быть подвержена деградации нуклеазами, находящимися в лизосомах и переходящими в активное состояние при гомогенизации тканей. Нуклеиновые кислоты чувствительны к расщеплению ферментами (нуклеазы, например, могут быть обнаружены на кончиках пальцев исследователя), они не терпят экстремальных значений рН и температуры.

Для выделения ДНК используют различные методики. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Большинство современных методов выделения ДНК из биологических тканей состоят из следующих этапов:

• разрушение клеточных стенок (при их наличии);
• лизис клеточных мембран;
• очистка от ингибиторов ферментативных реакций.

Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота. Этот этап можно проводить непосредственно в лизис-буфере, используемом для разрушения клеточных мембран.

Лизис клеточных мембран происходит в лизис-буфере: под воздействием поверностно-активных веществ или хоатропных солей происходит разрушение липидного бислоя. В состав лизис-буфера может входить протеиназа К, разрушающая протеины.

После разрушения клеточных стенок и лизиса мембран образуется мультикомпонентная смесь (раствор), содержащая, в том числе, ДНК.

После стадии лизиса возможны 2 основных принципиальных классических подхода для очистки целевой ДНК:

• очистка раствора с помощью методов органической экстракции (с помощью фенола, хлороформа) с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением в воде, либо ТЕ-буфере;
• дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе (чаще всего силикагели с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью), после нескольких стадий отмывки сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями, ДНК смывается водой или ТЕ-буфером.

Каждый из этих подходов имеет свои достоинства и недостатки.

В первом случае ДНК получается высокомолекулярной (фрагменты молекул имеют длину более 15000 нуклеотидных пар), однако возможны значительные потери ДНК, остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом – сильными ингибиторами ПЦР. Кроме того, к недостаткам метода нужно отнести очень высокую токсичность (использование в процессе выделения агрессивных органических соединений) и длительность процедуры выделения.

При использовании методов, основанных на нуклеосорбции, ДНК имеет высокую степень очистки, однако, возможна ее сильная фрагментация, а остаточные количества сорбента в конечном растворе также могут ингибировать ферментативные реакции.

В настоящее время ведущими в мире разработчиками наборов и систем для выделения ДНК используется принцип высаждения ДНК на сорбенте, запрессованном в микроколонку для центрифугирования, существенным недостатком таких наборов являются их высокая стоимость и потери ДНК после многократных промывок колонки, необходимых для удаления примесей.

Наиболее прост в использовании, экономичен и безопасен – метод выделения ДНК с использованием анионообменной смолы Chelex 100, который позволяет проводить эффективную экстракцию ДНК из различного биологического материала, широко применяемый в нашем отделении. Но получаемая при этом ДНК имеет так называемый килексный продукт, имеющий смесь ДНК и остатки продуктов распада клеточных элементов. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, и поэтому оценить ее количество и качество при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например бромистый этидий, трудно. Кроме того, Chelex 100 практически не может использоваться для экстракции ДНК из старых костных останков.

С целью поиска альтернативного метода выделения ДНК нами был взят на апробацию набор Diamond DNA Genomic DNA Extraction Kit for Animal Tissue Samples. Набор разработан специалистами в Алтайском государственном университете. С целью мониторинга набор использовался для выделения ядерной ДНК из пятен крови, волоса, содержащего волосяную луковицу, эпителиальных клеток, мышечной ткани и содержимого костного канала трубчатых костей.

Последовательность стадий:

1. Лизис клеток. В состав лизис-буфера входят компоненты предотвращающие адсорбцию ДНК на стенках пробирки и частицах SiO2 или Al2O3, используемых при механическом разрушении клеточных стенок. В состав также входят компоненты, предотвращающие окисление ДНК и эффективно связывающие полифенолы.
2. Адсорбция примесей, ингибирующих ПЦР с помощью сорбента (ДНК остается в растворе). Частицы сорбента имеют нанометровые размеры и не взаимодействуют с ДНК, что предотвращает ее механическую и химическую деградацию.
3. Дополнительная очистка раствора осаждением белков (ДНК остается в растворе). Происходит дополнительная очистка ДНК от белков, полисахаридов и компонентов лизис-буфера.
4. Осаждение и отмывка ДНК. Происходит селективное осаждение молекул ДНК высокоэффективным осадителем. Осаждающий буфер абсолютно нетоксичен и инертен; в отличие от спиртов, используемых для осаждения ДНК, не ингибирует ПЦР. Отмывка ДНК от солей и осадителя этанолом – дополнительная (необязательная) стадия очистки.
5. Растворение ДНК в ТЕ-буфере.

В процессе исследований в лаборатории нами были установлены следующие преимущества набора:

• получение высокомолекулярной ДНК, пригодной для амплификации;
• достаточно высокое качество очистки ДНК;
• отсутствие в составе набора высокотоксичных веществ (фенола, хлороформа, гуанидинтиоцианата, кетонов);
• низкие потери ДНК при экстракции;
• малое количество стадий (процесс выделения ДНК может занимать не более 30 мин);
• продолжительность хранения выделенной ДНК более 1 года (при -20°С);
• невысокая стоимость выделения одного образца.

Учитывая ограниченное количество данного на апробацию набора реагентов Diamond DNA Kit довольно трудно выявить все преимущества и слабые стороны набора, тем более сделать статистические выкладки по каждой группе носителей ядерной ДНК. Однако в результате исследования нами были сделаны следующие выводы: набор жизнеспособен, прост в использовании, экономичен, безопасен, позволяет получить высокомолекулярный, чистый препарат ДНК, пригодный для дальнейшего идентификационного анализа и работать с ним целесообразно. Тем более разработчики набора также не останавливаются на достигнутом и совершенствуют свои исследования.

Обоюдная работа в этом направлении продолжается.