Газохроматографическое определение морфина методом стандартной добавки

Publication in electronic media: 11.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/485
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2011 Вып. 17

А.Д. Носов, Л.И. Павлова

г. Новокузнецк

Газовая хроматография (ГХ) в силу своей высокой чувствительности и надежности по-прежнему остаётся одним из наиболее распространенных методов, применяемых в судебной химии для анализа отравляющих веществ.

В настоящее время для количественного определения морфина широко распространён метод абсолютной градуировки либо внутреннего стандарта. Первый из них основан на использовании зависимости между количеством компонента в пробе и параметрами пика. Эту зависимость определяют экспериментально, хроматографируя искусственные смеси (желательно, не менее трёх), и выражают либо в виде графика, либо аналитически. Точность результатов, получаемых этим методом, зависит от точности дозирования пробы.

При использовании метода внутреннего стандарта к навеске анализируемого вещества добавляется известное количество внутреннего стандарта – постороннего соединения, дающего на хроматограмме хорошо разрешённый пик. Затем, концентрацию определяемого компонента в анализируемом веществе рассчитывают по соответствующей формуле.

Для определения концентрации методом стандартной добавки необходимо записать две хроматограммы: анализируемой смеси; обогащённой определяемым компонентом исходной смеси (анализируемая смесь + добавка определяемого компонента).

К достоинствам данного метода следует отнести то, что он не требует знания калибровочных коэффициентов и позволяет, по однородности пика, более достоверно убедиться о присутствии в анализируемой смеси определяемого компонента, повышая тем самым доказательность ГХ метода. Основные недостатки: трудность выбора соединения стандарта, удовлетворяющего необходимым для него условиям; меньшая применимость для серийных анализов ввиду увеличения их продолжительности.

Условия газохроматографического определения

Хроматографирование проводили на газожидкостном хроматографе «Кристалл 2000М», с использованием ДАЖ (Дозатор Автоматический Жидкостный). Колонка кварцевая DB-5 30м*0,25мм, продолжительность анализа 35 минут, начальная температура колонки 1500С, режим нагрева колонки градиентный до 2600С за 2 минуты со скоростью нагрева 100С/мин, температура испарителя 2500С, температура детектора 2800С, газ-носитель – азот, расход газа-носителя 1,1 мл/мин (Р=100 кПа), детектор – ПИД, расход водорода 25мл/мин, расход воздуха 250мл/мин. Обработку хроматограмм проводили с помощью программы «Хроматэк Аналитик 2.5».

Методика проведения исследований

Упаренный досуха исследуемый экстракт (например, щелочное извлечение из мочи) растворяли в 500мкл 95° этилового спирта. К 250мкл исследуемого спиртового извлечения добавляли 100мкл стандартного раствора морфина с известной концентрацией (например, 300мкг/мл). Далее, проводили два ввода пробы по 2мкл: первый – исследуемое спиртовое извлечение, второй – исследуемое спиртовое извлечение, в которую была введена стандартная добавка морфина (рис. 1,2).

Рис. №1. а – Хроматограмма №1 (Щелочное извлечение из мочи), б – Хроматограмма №2 (Щелочное извлечение из мочи со стандартной добавкой морфина)

Аналитические характеристики морфина (время удерживания и площадь пика) из хроматограмм №1 и 2 представлены в табл. 1.

Таблица 1 Характеристики обнаруженных хроматографических пиков исследуемого извлечения до и после добавления стандартной добавки

Из таблицы следует, что однородность хроматографического пика со временем удерживания около 18,25 мин, а также соразмерное увеличение его площади после добавления стандартного раствора морфина, свидетельствуют об обнаружении морфина в исследуемой пробе.

Если время удерживания соответствующих исследуемых хроматографических пиков двух хроматограмм совпадают в пределах допускаемых отклонений, результат идентификации считают положительным. Если на хроматограмме исследуемой пробы с добавкой площадь исследуемого пика увеличивается на величину, соответствующую величине добавки, этот пик относится к определяемому компоненту. Если на хроматограмме исследуемой пробы с добавкой наряду с «сомнительным» пиком присутствует пик, время удерживания которого совпадает с соответствующим временем удерживания стандарта, то сомнительный пик не относится к определяемому компоненту.

Обработка результатов измерений

Концентрацию морфина в пробе рассчитывают методом стандартной добавки по формуле [5]:

,

где V⁰_{добавки} – объём добавляемой стандартной смеси, в мкл; C¹_{добавки} – концентрация добавляемого стандарта, в мкг/мл; V⁰_анализ – объём анализируемой пробы, взятой для разведения с добавкой, в мкл; S¹_{анализ+добавка} – площадь анализируемой пробы с добавкой; S¹_анализ – площадь анализируемой пробы; V_анализ – объём анализируемой пробы, вводимой в хроматограф, в мкл; V_{анализ+добавка} – объём анализируемой пробы с добавкой стандарта, вводимой в хроматограф, в мкл; C_i – концентрация компонента в пробе, в мкг/мл.

Расчёт концентрации морфина в объекте проводят по формуле:

,

где С_i – концентрация компонента (морфина) в пробе, в мкг/мл; V₁ – объём элюента (этанола), в мл; V₂ – объём экстракта полученного при изолировании биоматериала, в мл; V₃ – объём аликвоты экстракта извлечения, в мл; G – масса (или объём) биоматериала взятого для изолирования, в г (или мл); X_i – концентрация компонента (морфина) в объекте, в мкг/г (или мкг/мл).

В нашем случае концентрация морфина в пробе составила 188,23мкг/мл. При анализе исследуемой пробы на микроколоночном высокоэффективном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» методом абсолютной градуировки концентрация морфина в пробе составила 182,57мкг/мл. Расхождение результатов составила 5,66мкг/мл (3%). При анализе исследуемой пробы методом ГЖХ на хроматографе «Кристалл 2000М» методом абсолютной градуировки концентрация морфина в пробе составила 191,24мкг/мл – расхождение 3,01мкг/мл, что составляет около 2%.

Выводы

Предложенная методика ГЖХ исследования морфина методом стандартной добавки позволяет без построения калибровочного графика и знания калибровочных коэффициентов определить концентрацию морфина в пробе. Данный метод позволяет, по однородности пика, более достоверно убедиться о присутствии в анализируемой пробе морфина, повышая тем самым доказательность газохроматографического метода. Использование метода стандартной добавки целесообразно при единичных определениях.

Список литературы

1. Айвазов Б.В. // «Практическое руководство по хроматографии: учебное пособие для студентов химических и химико-технологических специальностей вузов». – М. – «Высшая школа». 1968.
2. Алексеев В.Н.// «Количественный анализ». – М. – «Химия». – 1962.
3. Барсукова З.А.// «Аналитическая химия». – М. – «Высшая школа». – 1990.
4. Посыпайко В.И., Козырева Н.А., Логачёва Ю.П.// «Химические методы анализа». – М. – «Высшая школа». – 1989.
5. Царев H.И., Царев В.И., Катраков И.Б. // «Практическая газовая хроматография: Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа»». — Барнаул: Изд-во Алт. ун-та. – 2000.