Применение тонкослойной хроматографии и хромато-масспектрометрии при обнаружении алкалоидов в патологическом материале животных

Publication in electronic media: 11.11.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/472
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2011 Вып. 17

М.В. Бойченко, Г.А. Слащинин, Т.С. Шахворостова

г. Красноярск

В практике химико-токсикологического отдела любой ветеринарной лаборатории определение алкалоидов стоит на особом месте. Как известно алкалоиды способны вызвать отравление животных. Источником токсичных алкалоидов могут служить некачественные корма, в частности сено и сенаж. При хранении алкалоиды практически не разрушаются, а, попав в организм животных, могут вызвать расстройство гемодинамики и другие патологические изменения.

В то же время, в ветеринарной практике применяется достаточно много лекарственных препаратов, которые либо сами являются алкалоидами (кофеин), либо дают реакцию на общие алкалоидные реактивы, например на реактив Драгендорфа. В последнее время, ветеринарные врачи сталкиваются с проблемой отравления мелких домашних животных некоторыми лекарственными препаратами, например тубазидом. Тубазид (изониазид) – в химическом отношении гидразид изоникотиновой кислоты, является противотуберкулезным препаратом. При появлении первых симптомов отравления у животных (отказ от корма, сильное возбуждение животного, сильные боли в брюшной области) применяется симптоматическая терапия, в частности назначаются инъекции но-шпы, папаверина и др. Если лечение эффекта не дает и животное гибнет, то возникает необходимость его вскрытия для постановки диагноза. Для определения в патологическом материале токсикантов, исследование на алкалоиды является обязательным.

При положительной реакции на алкалоиды перед врачом токсикологом встает вопрос: на какое вещество сработал реактив: на лекарственное или токсическое. Окончательного ответа на этот вопрос во многих случаях нет и в заключении указывается наличие алкалоидов, что и принимается за причину гибели животного.

Методика исследования состоит в том, что алкалоиды извлекаются подкисленной водой, из которой впоследствии действующие начала экстрагируются хлороформом. Далее, водный раствор подщелачивается и проводится повторная экстракция хлороформом. В объединенных хлороформных экстрактах определяется наличие алкалоидов. Для этой цели используются реактивы: Бушарда, Зонненштейна, Шейблера, но наиболее значимым был реактив Драгендорфа.

Целью данной работы явилось определение значения метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) и хромато-масспектрометрии (ГХ/МС) для обнаружения токсических и лечебных компонентов в патологическом материале.

Для этого решались следующие задачи: 1. Исследовать общую, цветную реакцию на алкалоиды с тубазидом, папаверином, но-шпой. 2. Выявить приемлемость определения различных препаратов разными методами (ТСХ, ГЖХ МС, общеосадительные реактивы). 3. Провести дифференциацию различных препаратов, выделяемых из патологического материала с помощью метода ТСХ и ГЖХ МС.

Для опыта было сформировано четыре группы кроликов. Одна группа получала препарат тубазид (изониазид) внутрь; животным второй группы вводился папаверин в дозе 0,5мл 2% раствора 2 раза в день; третьей группе – но-шпу в дозе 0,3 мл 2 раза в день. Четвертая группа была контрольной. Для исключения возможного наличия алкалоидов кормах они были исследованы на их наличие. После окончания опыта животные были подвергнуты эвтаназии. При вскрытии изымались внутренние органы: почки, печень, стенка желудка. Алкалоиды изолировались подкисленной водой, с последующим извлечением действующего начала в хлороформ. После выпаривания, остаток подвергался очистке, растворялся в 200-500мкл хлороформа, исследовался на наличие алкалоидов с реактивом Драгендорфа, методом ТСХ, методом ГЖХ МС.

Наличие алкалоидов реактивом Драгендорфа в исследуемых тканях представлено в табл. 1.

Таблица 1. Результаты определения препаратов в органах животных групповым методом

Из таблицы 1 видно, что все исследуемые органы животных, получавшие изониазид дали положительную реакцию с реактивом Драгендорфа. В органах же животных, получавших спазмолитические препараты алкалоиды не были выявлены. Это свидетельствует о том, что лечебные концентрации спазмолитических препаратов не могут быть обнаружены с помощью группового реактива на алкалоиды, видимо, из-за недостаточной концентрации препаратов в организме или метаболизма.

Результаты обнаружения препаратов методом тонкослойной хроматографии представлены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты обнаружения препаратов методом тонкослойной хроматографии

При определении величины Rf были получены следующие результаты (табл. 3).

Таблица 3. Результаты определения величины Rf.

При исследовании органов методом хромато-массспектрометрии получено (табл. 4)

Таблица 4. Результаты обнаружения препаратов методом хромато-массспектрометрии.

Как видно из таблиц №№2,3,4, методы тонкослойной хроматографии и хромато-массспектрометрии позволили определить наличие не только изониазида, но и таких препаратов, как но-шпа, папаверин, которые не определяются групповым реактивом.

Выводы: Метод группового определения алкалоидов с реактивом Драгендорфа способен выявить токсические концентрации алкалоидов, в частности тубазида. Лечебные концентрации таких лекарственных препаратов, как но-шпа и папаверин, метод группового определения не выявляет. Наименьшая концентрация препарата но-шпа при введении парэнтерально содержится в легочной ткани и стенке желудка. Методы тонкослойной хроматографии и хромато-масспектрометрии позволяет выявлять наличие в органах не только токсические концентрации лекарственных препаратов, но и лечебные, что позволяет провести их дифференциацию.