Судебно-медицинская оценка отравлений при малых и сверхмалых концентрациях наркотиков в крови с учетом генетического полиморфизма CYP2D6; CYP2C19

Publication in electronic media: 11.12.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/572
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15

В. В. Сорокина

г. Омск

Широкая распространенность острых отравлений опиатными наркотиками (героин, морфин и т. д.), а также значительное число в популяции населения РФ лиц, систематически употребляющих опийные наркотики, требует специальных подходов к оценке токсического действия опиатов. Широкое распространение в нашей стране метода количественного определения опиатов в крови показало, что в экспертной практике встречаются как случаи смерти при концентрации морфина до 0,5 мг/л, так и в интервале — 2-4 мг/л. (Шигеев С. В., 2005) При этом, у живых лиц в крови встречаются самые разнообразные концентрации морфина от следовых и малых до 2-3 мг/л. Это позволяет предположить, что индивидуальная переносимость морфина и риск ущерба здоровью в значительной мере зависит от степени активности ферментов метаболизма ксенобиотиков и полиморфизма генов, кодирующих эти ферменты.

Это в свою очередь требует определенных оценок, без которых смерть от отравления героином при концентрации в крови 0,5 мг/л и в другом случае 3,5 мг/л при одной и той же непосредственной причине смерти — острой дыхательной недостаточности, без специальных исследований выглядит не убедительно.

В зависимости от скорости метаболизма ксенобиотиков в популяции населения выделяют следующие группы:

1. Распространенные (активные) метаболизаторы. Имеющие нормальный ген того или иного фермента метаболизма.
2. Медленные метаболизаторы — носители мутаций гена того или иного фермента метаболизма, приводящих либо к синтезу дефектного фермента, либо вообще к отсутствию синтеза определенного фермента, результатом чего является снижение ферментативной активности или даже ее отсутствие по конкретному субстрату.
3. Сверхактивные или быстрые метаболизаторы — носители мутаций гена того или иного фермента метаболизма, приводящих к синтезу фермента с высокой метаболизирующей активностью.

Гены, кодирующие ферменты, которые метаболизируют ксенобиотики, характеризуются значительным полиморфизмом, и наличие делеций или «медленных» аллелей может приводить к дисбалансу процессов детоксикации (Lapple E, 2003).

CYP2D6; CYP2C19 — изоферменты первой фазы метаболизма ксенобиотиков морфологическим субстратом для которых, наряду с другими ксенобиотиками являются алкалоиды опия — морфин, кодеин. Наличие «медленных» аллелей в генах, кодирующих эти изоферменты, приводит к либо к отсутствию синтеза этих ферментов или к синтезу ферментов с низкой активностью.

Целью работы является выявление генетических маркеров, которые отображают программную регуляцию ферментных систем, участвующих в метаболизме ксенобиотиков и конкретно опиатов. Материалы и методы исследования:

Работа основана на результатах анализа наблюдений случаев смерти лиц, погибших с установленными данными употребления наркотических веществ. Проведено аутопсийное исследование 189 трупов лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков за период 2005-2007гг. Исследование трупов проводилось на базе ГУЗ «ООБСМЭ».

Сведения об имевшейся наркотической зависимости в 35 наблюдениях были получены из амбулаторных карт, в 48 случаях в беседе с родственниками и близкими товарищами умерших, а также из материалов уголовных дел и протоколов осмотра трупа на месте происшествия.

При исследовании трупов на длительное использование наркотиков указывали: следы от внутривенных инъекций различной давности 83 наблюдения - 93%, фиброзное очаговое утолщение стенок подкожных вен 39 наблюдений — 43,8%, положительный результат количественного определения концентрации морфина в крови, 174 наблюдения — 83.1%

Из всего массива случаев нами была выделена группа лиц количеством 130 человек давность наступления смерти, которых на момент осмотра трупа в морге не превышала 12 часов. Также была сформирована группа контроля — субъекты до 35 лет погибшие в результате насильственной смерти, без признаков употребления наркотических веществ внутривенно — 100 человек, давность наступления смерти которых, на момент осмотра трупа в морге также не превышала 12 часов. Проводился забор венозной крови (4-5мл) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с этанольным осаждением. Исследование полиморфизма генов изоферментов цитохрома Р450, «медленных» мутантных аллелей CYP 2D6*3*4; CYP2C 19*2*3 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПДРФ анализ).

Использованы олигонуклеатидные праймеры синтезированные в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Структуры олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице 1.

Таблица 1 Структуры олигонуклеотидных праймеров

Амплификацию проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-НС1 (рН 8,9), 50мМ КС1, 1,7мМ MgCl, 0,05% Tween 20, с добавлением 0,2 мМ-ого раствора dNTP, 0,5 мкМ-го раствора праймеров, 20нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq- ДНК-полимеразы. Реакционную смесь в объеме 20мкл покрывали 40мкл минерального масла. ПЦР проводили на амплифика-торе «Терцик» («ДНК-Технология», Москва).

Для определения полиморфных вариантов гена CYP2D6 использовали ПЦР с дальнейшей рестрикцией амликонов эндонуклеазами рестрикции: Mspl — для генотипирования полиморфного локуса аллель *3 и Bst2U — для генотипирования полиморфного локуса аллель *4*6.

Для определения полиморфных вариантов гена CYP2C19 использовали ПЦР с дальнейшей рестрикцией ампликонов эндонуклеазами рестрикции Mspl для генотипирования полиморфного локуса аллель*2 и BamHI - для генотипирования полиморфного локуса аллель*3.

Анализ рестрикционных смесей проводили с помощью электрофореза в 3%-м агарозном геле с бромистым этидием.

Результаты исследований были статистически обработаны при помощи углового преобразования Фишера и Χ². Статистически достоверными считали различия при Р<0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании полиморфных вариантов генов CYP 2D6*3*4*6 для удобства анализа, а так же поскольку 6 аллель встречалась редко, полиморфизм гена генов CYP 2D6, мы описывали с учетом только аллели 3 и 4.

Мы получили 6 групп с генотипами 1/3 1/1 и 3/3 соответственно по 3 аллели и 1/1, 1/4 и 4/4 по 4 аллели. После этого мы вычислили частоту встречаемости данных генотипов среди исследуемых лиц и в группе контроля, а так же частоту встречаемости аллелей соответственно. Достоверный уровень статистической значимости различия был получен при исследовании CYP 2D6*3 (табл. 2).
Таблица 2 Частота встречаемости генотипов гена CYP2D6*3

По 4 аллели достоверный уровень статистической значимости различия выявлен не был, хотя в группе лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков, доля наблюдений с генотипом 4/4 возрастала.

Среди исследований генотипов CYP2C 19*2*3, которое проводилось таким же образом, распределение генотипов и аллелей в исследуемых группах и группе контроля не достигло статистической значимости различия, но количество гомозиготных (медленных) аллелей 2/2 и 3/3 в исследуемой группе лиц погибших в связи с употреблением морфина возрастало.

В группе гомозиготных носителей медленных мутантных аллелей CYP2D6 и CYP2C19 были идентифицированы лица, возраст которых составлял от 16 до 20 лет, стаж употребления наркотиков от 1 инъекции до 1 года. При этом, проанализировав результаты количественного определения наркотика в крови этой группы наблюдений, мы установили, что концентрация морфина в крови трупов колебалась от следовых количеств до 0,5 мг/л (табл. 3).

Таблица 3

Абсолютные показатели распределения концентрации наркотика в крови трупа среди гомозиготных аллелей CYP 2D6*3*4; CYP2C19*2*3

После этого мы проанализировали причины смерти лиц погибших в связи с употреблением морфина среди носителей гомозиготных медленных мутантных аллелей CYP 2D6 и CYP 2C19. Непосредственной причиной смерти этих лиц явилась острая дыхательная недостаточность. При этом на секции, мы наблюдали: признаки острой эмфиземы и дистелектазов в легких, субплевральные кровоизлияния, периваску-лярные кровоизлияния в стволе головного мозга, острое венозное полнокровие внутренних органов. Следовательно, мы можем говорить о так называемой «смерти на игле» при введении сравнительно небольшой дозы наркотического вещества, которая для них явилась смертельной.

При морфологическом исследовании трупов лиц данной группы мы не выявили признаков хронического употребления наркотических веществ, а именно множественных следов от инъекций различного срока давности, признаков хронических воспаления в органах и тканях: хронического гепатита, кардиопатии, токсической энцефалопатии, хронического бронхита с бронхопневмонией, которые мы обычно наблюдаем при исследовании трупов лиц хронически употребляющих наркотики.

Определяющим в морфогенезе опийной интоксикации является полиморфизм генов, контролирующих скорость первой фазы метаболизма ксенобиотиков. Медленные метаболизаторы (гомозиготы по му-тантным аллелям CYP 2D6*3*4; CYP2C19*2*3) погибают при сверхмалых концентрациях морфина в крови (до 0.5мг/л).

Распространенные метаболизаторы погибают при средних и высоких концентрациях морфина в крови (1-4.0мг/л). При этом у них развивается острая дыхательная или острая сердечная недостаточность, обусловленная вторичными поражениями сердца и печени.

По результатам исследования изоферментов цитохрома Р450 можно полагать, что острые отравления характерны в основном в случаях, где манифестируют медленные метаболизаторы ксенобиотиков - гомозиготные носители «медленных» мутантных аллелей генов CYP2D6 и CYP2C19.

В случаях длительной наркомании, с выраженными висцеральными проявлениями манифестируют быстрые и распространенные метаболизаторы. Генетически запрограммированная метаболизация ксенобиотиков из группы морфина и морфиноподобных веществ приводит к появлению большого спектра токсических изменений внутренних органов, которые и составляют морфогенетическую основу хронической наркотической болезни.

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов CYP2D6*3A и CYP2D6*4A выявил достоверные отличия между лицами, употреблявшими наркотические вещества и группой контроля. Для оценки спорных и сложных случаев отравления сверхмалыми дозами опиатов (менее 0,5 мг/л) в крови следует помимо морфологической картины и непосредственной причины смерти исследовать генетический полиморфизм CYP 2D6*3*4

Таким образом, однозначно выявляются медленные метаболизаторы, которые погибают сразу после инъекции обычной и даже небольшой дозы, а распространенные и быстрые метаболизаторы, которые погибают, как правило, через несколько лет после начала употребления наркотиков. Для подтверждения того, что тот или иной субъект является медленным или быстрым метаболизатором следует использовать исследования CYP2D6*3A и CYP2D6*4A, CYP2C19*2A и CYP2C19*3A. Указанная методика может быть легко выполнима в любом Бюро судебно-медицинской экспертизы, где имеется биохимическая и генетическая лаборатория.

В этой связи, ранняя распространенная точка зрения о том, что смертельными являются концентрации морфина в крови выше 3,0мг/л, не может быть принята в расчет в случаях, когда имеет место мутация вышеназванных аллелей генов, контролирующих метаболизм морфина. В свою очередь (в хирургической, анастезиологической, онкологической практике), это требует исследования CYP2D6*3A и CYP2D6*4A, CYP2C19*2Ah CYP2C 19*3А перед медицинским применением морфина, так как если субъект является медленным метаболизатором морфина, то даже обычная терапевтическая доза морфина для него может быть смертельной. Этот факт необходимо учитывать в случаях неожиданной смерти больных, которым было начато медицинское применение морфина, а также в случаях неожиданной смерти в ходе премедикации перед дачей наркоза.

Полученные в работе данные позволяют по-новому взглянуть и на оценку случаев смерти наркоманов, где субъект погибает после первого применения наркотика. В ходе следствия и юридических оценок таких случаев возникает сложность в оценке характера и причины смерти субъекта. Учитывая устанавливаемый судебно-медицинской экспертизой факт малых или следовых количеств наркотика в крови и обычную для отравлений наркотиками причину смерти - острую дыхательную недостаточность, возникает вопрос о мнимом несоответствии заключения об отравлении наркотиками (так называемой «передозировке») и обнаруженной в крови концентрации морфина. Разрешение этого вопроса возможно лишь при исследовании генетического полиморфизма (CYP2D6*3A и CYP2D6*4A, CYP2C19*2A и CYP2C19*3A), то есть индивидуального метаболического профиля субъекта. Все это требует 292
изменения подходов к оценке случаев смерти с применением опиатных наркотиков.