Изолирование, идентификация и количественное определение эналаприла в биоматериале

Publication in electronic media: 21.06.2010 under http://journal.forens-lit.ru/node/173
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15

Л. Г. Воронкова, Л, Е. Кудрикова, А. Н. Рыженков

г. Барнаул

Эналаприл — гипотензивное средство, является очень востребо­ванным препаратом. По данным Интернет-ресурса «Большой город» он входит в десятку самых покупаемых лекарственных средств в России.

В литературных источниках отсутствуют данные о смертельных отравлениях эналаприлом. Однако, в 2008 г. в практике работы токси­кологической лаборатории было 8 несмертельных случаев отравления эналаприлом, а в 2007 г. — 1 смертельное отравление в сочетании со снотворными.

Целью нашего исследования является изучение свойств препарата эналаприл и разработка частной методики химико-токсикологического анализа.
Эналаприл применяется в виде соли малеиновой кислоты, МНН:
Эналаприла малеат, Химическое название: 1-[N-(S)-1-Kapбoкси-3-фенилпропил]-L-аланил-L-пролин-1' этиловый эфир.

Предварительно нами было установлено, что в коротковолновой области спектра эналаприл не имеет четко выраженного максимума, лишь наблюдается перегиб спектральной кривой при длине волны 200 — 210 нм, где интенсивно поглощают примеси. Поглощение в макси­муме при λ=260 нм невысокое, поэтому предел обнаружения препарата низкий. Следовательно, методом УФ-спектрофотометрии эналаприл ис­следовать нецелесообразно.

В настоящее время для идентификации и количественного опре­деления веществ широко используется метод высокоэффективной жид­костной хроматографии (ВЭЖХ), благодаря высокой специфичности и чувствительности. Исследование водно-спиртового раствора энала­прила проводили с помощью хроматографа серии «Милихром-А-02», в градиентном режиме. Колонка Нуклеосил-С-18 2x75 мм, d=5 мкм. Элюент А — 0,01% раствор трифторуксусной кислоты, элюент В — ацетонитрил — 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (9:1), концен­трация элюента В менялась от 30 до 90% за 10 минут. Скорость подачи элюента 100 мкл/мин, температура колонки 35°С.

На хроматограмме наблюдали 2 пика, первый пик соответствует малеиновой кислоте, второй — эналаприлу.

Параметры удерживания и спектральные отношения препарата эналаприла малеата приведены в таблице 1.

Таблица 1

Параметры удерживания и спектральные отношения эналаприла и малеиновой кислоты

Таким образом, метод ВЭЖХ позволяет надежно идентифициро­вать эналаприл по параметрам удерживания и спектральным отношени­ям. Количественное определение проводится по высоте или площади пика. Чувствительность методики для эналаприла составила 1 мкг/мл. Поэтому ВЭЖХ нами выбран как основной метод идентификации и ко­личественного определения препарата.

В качестве дополнительного метода применяли тонкослойную хроматографию. Наиболее чувствительным способом обнаружения эна­лаприла в методе ТСХ является последовательная обработка хроматограмм раствором сульфата ртути (II) и раствором дифенилкарбазона в хлороформе, при этом наблюдались сиреневые пятна. Были подобраны две системы растворителей: ацетон-муравьиная кислота (20:1), (значе­ние Rf 0,79±0,05) и хлороформ-ацетон-муравьиная кислота (10:2:2), (значение Rf 0,54±0,1).

Для разработки метода изолирования эналаприла необходимо изучить его способность экстрагироваться из водных растворов. Коли­чество извлеченного препарата определяли методом ВЭЖХ. Графики зависимости степени экстракции (R%) эналаприла из водных растворов различными растворителями при различных значениях рН представле­ны на рисунке 1.

Рис. 1. Зависимость степени экстракции эналаприла из водных растворов от рН среды

Степень экстракции препарата хлороформом и эфиром зависит от рН, максимальная степень экстракции наблюдается при рН 4,44, однако для эфира составляет 18,03%, а для хлороформа 98,69%. Степень экс­тракции гексаном незначительна и от рН не зависит.

С учетом полученных данных разработана схема химико-токси­кологического анализа препарата эналаприл. За основу был взят метод изолирования с помощью нейтрального ацетона, разработанный В.А. Карташовым с соавт. (1988). В методику были внесены некоторые мо­дификации: на этапе очистки вместо 20 мл 0,5 н. соляной кислоты бра­ли 10 мл; на конечном этапе изолирования вместо эфира использовали хлороформ; высаливающий агент — натрия хлорид добавляли на этапе экстракции из кислого раствора (в оригинальной методике его добавля­ют при экстракции веществ основного характера). В этом случае выход вещества в модельном эксперименте составил 71%. Схема исследова­ния биологического материала представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Схема химико-токсикологического анализа препарата эналаприл

Эффективность разработанной методики была доказана в остром опыте на лабораторных животных крысах. На анализ брали внутренние органы (печень, почки, стенка желудка), а также содержимое желудка. При исследовании во всех органах был обнаружен эналаприл и его ме­таболиты. Данные по количественному содержанию эналаприла пред­ставлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты количественного определения содержания эналаприла в органах животных

Как следует из таблицы, максимальная концентрация эналаприла обнаружена в содержимом желудка и соответствует 1326,16 мг%, это говорит о том, что препарат на момент гибели животного всосался не полностью. Минимальная же концентрация обнаружена в печени и со­ответствует 4,87мг%, что говорит о том, что скорость биотрансформа­ции эналаприла достаточно высокая.

Во всех биологических объектах обнаружены метаболиты, при­чем наибольшее их количество найдено в печени и почках, меньше в стенке желудка и его содержимом.

Таким образом, эналаприл изолируется из биоматериала ней­тральным ацетоном, с последующим высаливанием и экстракцией хло­роформом. Выход вещества составляет около 70%. Для идентификации эналаприла можно применять ТСХ и ВЭЖХ.