Химико-токсикологическое исследование лоразепама

Publication in electronic media: 15.08.2010 under http://journal.forens-lit.ru/node/189
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15

Л. Е. Кудрикова, Е. Н. Маскина, Л. Г. Воронкова

г. Барнаул

Смертельные отравления производные 1,4-бензодиазепина до­вольно часто встречаются в практике судебной химии, особенно в соче­тании с этиловым алкоголем, барбитуратами, производными фенотиазина, антигистаминными препаратами.

Определенный интерес в практике судебно-химического анализа вызывает лоразепам, методов определения которого в биоматериале, нами в доступной литературе не найдено. Лоразепам (7-Хлор-5-(орто-хлорфенил)-2,3-дигидро-3-окси-1Н-1,4-бензодиазепин-2-OH) применяется под названиями: Апо-Лоразепам, Калмезе, Лорам и др.. Препарат оказывает анксиолитическое, седативное, снотворное, противосудорожное, центральное миорелаксирующее, противорвотное действие. Стабилизирует вегетативную нервную сис­тему.

В настоящее время выделяют два основных направления в анали­зе биологических объектов на производные 1,4-бензодиазепина: по про­дуктам гидролиза — аминобензофенонам и по нативным соединениям.

Первое направление включает в себя три основных этапа: кислот­ный гидролиз биологических объектов, экстракцию аминобензофенонов после подщелачивания органическими растворителями, очистку и анализ экстрактов. Основное преимущество исследования препаратов по производным состоит в том, что данный способ позволяет суммарно определять нативное соединение и ряд его метаболитов в виде бензофенонов. Недостатком является тот факт, что ряд соединений образуют одинаковые бензофеноны и идентификация препарата невозможна.

Второе, более сложное направление, включает изолирование нативных соединений методами экстракции или сорбции. Для биоло­гических жидкостей используется прямая экстракция органическими растворителями из щелочной среды. Для изолирования из внутренних органов могут применяться различные методы. В настоящей работе нами апробирован метод изолирования нейтральным ацетоном по Карташову. Далее для обнаружения и количественного определения произ­водных бензодиазепина и их метаболитов используется комплекс анали­тических методов.

Цель работы—оценка метода изолирования лоразепама нейтраль­ным ацетоном по В. А. Карташову с соавт. (1988) и выбор подходящих методов исследования извлечений, проверка разработанной методики анализа в эксперименте на животных.

Методы исследования. Предварительный метод—ТСХ. В качестве основного метода обнаружения и количественного определения лоразепама и продукта его гидролиза нами была выбрана высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая обладает достаточно вы­сокой чувствительностью и специфичностью. Исследовали спиртовые растворы препаратов производных 1,4-бензодиазепина с концентрацией 200 мкг/мл. Хроматографирование проводили на приборе Милихром А-02, колонка 2x75 мм, dp = 5 мкм, неподвижная фаза — ProntoSil C-18. Растворы препаратов хроматографировали в градиентном режиме: элюент А — вода, элюент В — ацетонитрил. Концентрация ацетонит-рила увеличивалась от 30 до 100% за 15 мин. Скорость подачи элюента 100 мкл/мин. Идентифицировали препараты по временам удерживания и спектральным отношениям. Время удерживания лоразепама состави­ло 7,0 минут. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования препаратов производных 1,4-бензодиазепина методом ВЭЖХ

Растворы бензофенонов, которые получены при кислотном гидро­лизе, хроматографировали в аналогичных условиях, но градиентный ре­жим был другим: концентрация ацетонитрила в элюенте увеличивалась от 50 до 100% за 15 минут. Время удерживания бензофенона лоразепама составило 7,7 минут. Результаты хроматографирования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты исследования бензофенонов производных 1,4-бензодиазепина методом ВЭЖХ

Спектр 2-амино-5,2'-дихлорбензофенона (продукта гидролиза ло­разепама) представлен на рис. 1.

Рис. 1. Спектр продукта гидролиза лоразепама

Максимумы поглощения наблюдаются при длинах волн 233 и 266 нм, что соответствует литературным данным (Еремин С. К. с соавт., 1993).

Из данных приведенных в таблице 2 можно сделать вывод, что выбранные условия хроматографирования позволяют идентифициро­вать лоразепам и его бензофенон в присутствии других производных 1,4-бензодиазепина и продуктов их гидролиза, а также лоразепам и его бензофенон при совместном присутствии, так как времена удерживания и спектральные отношения отличаются от показателей других бенздиазепинов.

Изолирование и очистка. Изолирование лоразепама из биологи­ческого материала (ткань печени) проводили с помощью нейтрально­го ацетона по методике, описанной В. А. Карташовым с соавт. (1988). Ввиду того, что препарат обладает амфотерным характером, на исследо­вание брали извлечения, как из кислой, так и из щелочной среды. Извле­чения из кислой и щелочной среды делили на две части и исследовали методом ВЭЖХ, одну часть — без очистки, другую часть — после очистки методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Результаты исследова­ния представлены в таблице 3.

Таблица 3

Концентрация лоразепама при изолировании нейтральным ацетоном из кислой и щелочной среды без очистки и после очистки

Из таблицы 3 следует, что наиболее эффективно исследование суммы извлечений без очистки. Очистка извлечений на ТСХ приводит к значительным потерям исследуемых веществ.

Исследование биологического материала по продуктам гидроли­за. Гидролиз лоразепама проводили в течение 60 минут, в качестве экстрагента использовали гексан. Экстракты исследовали методом ВЭЖХ, в приведенных ранее условиях. В результате на хроматограмме обна­ружены два пика с временами удерживания 7,7 и 8,5 минут. Основы­ваясь на данных о времени удерживания (7,7 минут) и спектральных отношениях сделали вывод, что первый пик принадлежит бензофенону лоразепама.

При хроматографировании извлечений холостого опыта пиков, мешающих определению исследуемых веществ, не было обнаружено.

Проверка методики в эксперименте на животных. Крысе с по­мощью зонда в желудок ввели водную суспензию таблеток лоразепа­ма, содержащую 30 мг действующего вещества. Через 1,5 часа крысу усыпили эфиром. Для проведения анализа у животного были взяты пе­чень и желудок с содержимым. Одну половину органов исследовали по нативному веществу с использованием ацетонового метода изолирова­ния, другую — взяли для исследования методом кислотного гидролиза. В извлечении из печени был обнаружен пик со временем удерживания (7,02 минуты), что соответствует лоразепаму. Выход нативного вещес­тва из кислой среды составил 4,94 мкг%, из щелочной среды — 5,76 мкг%. В результате анализа извлечений из желудка также был обнару­жен лоразепам, выход которого из кислой среды составил 82,44 мкг%, из щелочной — 90 мкг%.

Результаты ВЭЖХ исследования были подтверждены анализом извлечений методом ТСХ. Пятна обнаруживали путем последователь­ной обработки пластинки раствором ртути сульфата и дифенилкарбазо-на. При обработке хроматограмм реактивом Браттона-Маршала красных пятен не наблюдали, что свидетельствует об отсутствии в извлечении бензофенонов. При исследовании извлечений из желудка методом ТСХ, получились аналогичные результаты — обнаружилось нативное вещес­тво, бензофенон не был обнаружен.

При исследовании биологических объектов методом кислотного гидролиза в извлечении из печени было обнаружено два пика, времена удерживания которых составили 7,7минут- бензофенон и 8,5 минут- по­бочный продукт гидролиза. При исследовании извлечения из желудка были обнаружены те же два вещества.

При исследовании гидролизатов из печени методом ТСХ на хроматограмме реакцией Браттона-Маршала, проявлялись ярко-оранжевые пятна, что свидетельствует о наличии бензофенонов, нативное вещест­во не было обнаружено.

Таким образом, лоразепам нативный и его бензофеноны можно извлечь из биоматериала нейтральным ацетоном по В.А.Карташову с последующей идентификацией методами ТСХ и ВЭЖХ.