Изолирование и идентификация бисопролола при судебно-химических исследованиях

Publication in electronic media: 11.12.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/569
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Новосибирск 2009 Вып. 15

В. Б. Русинович, В. Л. Кнауб, Б. С. Жаркое

г. Барнаул

Бисопролол (Конкор) - (±)-1-[[λ-(2-Изопропоксиэтокси)-пара-толил]-окси]-3-(изопропиламино)-2-пропанол. По фармакологическим свойствам является кардиоселективным βl-адреноблокатором. Основным показанием к применению является: артериальная гипертензия, стенокардия, постинфарктный период. По химическому строению и фармакологическим свойствам близок к препарату метопролол (Эгилок) (Карташов В. А. с соавт., 1988). Представляет собой белый кристаллический порошок, легко растворим в воде, хлороформе, этаноле и метаноле. Константа диссоциации рКа=9.57. При пероральном приеме практически полностью всасывается из ЖКТ. Максимальные концентрации в крови достигаются через 2 - 4 часа после перорального приема. Он умеренно растворяется в липидах и быстро и широко распределяется в организме. Приблизительно 50% введенной дозы метаболизируется в печени до фармакологически неактивного полярного метаболита, который, также как и нативное соединение, экскретируется почками.

В отличие от метопролола, который хорошо изучен в химико-токсикологическом отношении, бисопролол относится к препаратам, представляющим интерес для химико-токсикологического исследования.

Цель настоящей работы - разработка методов изолирования и идентификации бисопролола, выделенного из биологического материала.

Экспериментальная часть

Бисопролол является вторичным алифатическим амином, проявляет достаточно сильные основные свойства (рКа=9.57), в связи с этим экстракцию его из водной фазы в органический растворитель производили при рН 11 - 12.

Изолирование бисопролола из биологического материала

Для изолирования бисопролола из биологического материала использовали два метода изолирования: ацетоном (Карташов В.А., 1988) и подкисленной водой (А.А. Васильева). Изолирование проводили из 25 г измельченной печени, к которой предварительно добавляли по 10, 15 и 20 мг бисопролола.

Полученные экстракты подвергали дополнительной очистке методом тонкослойной хроматографии.
Количественное определение бисопролола проводили спектро-фотометрическим методом в максимуме поглощения при длине волны 278 нм в 0,1 н растворе соляной кислоты (по экспериментально определенному удельному коэффициенту поглощения, равному 25).

Результаты изолирования бисопролола из ткани печени представлены в таблице 1.

Таблица 1 Изолирование бисопролола из биологического материала

Из представленных в таблице данных следует, что бисопролол, обладая достаточно сильными основными свойствами, в кислом извлечении не обнаруживается (как по методу Васильевой, так и по методу Карташова). Нейтральным ацетоном, по сравнению с подкисленной водой, из ткани печени изолируется приблизительно в 2 раза больше бисопролола (8,4%).

Идентификация бисопролола, выделенного из биологического материала

Параллельно с идентификацией бисопролола изучали вещество, близкое по химическому строению - метопролол. Для этого бисопролол и метопролол исследовали с помощью:

• химических тестов;
• спектрофотометрии в УФ области спектра;
• тонкослойной хроматографией (ТСХ) на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ;
• высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием микроколоночного жидкостного хроматографа « Ми-лихром А-02»;
• газожидкостной хроматографией (ГЖХ) на газовом хроматографе «Кристалл 5000 М».

Исследование бисопролола и метопролола реакциями окрашивания

Для определения бисопролола и метопролола реакциями окрашивания использовали реактивы Либермана, Марки, Манделина, концентрированную серную кислоту, 5% раствор хлорида железа (III). Данные проведенных химических тестов представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты химических тестов на бисопролол и метопролол

Исследования показали, что несмотря на сходство в химическом строении бисопролола и метопролола, реакции окрашивания (с реактивом Марки, с серной концентрированной кислотой) позволяют различить эти препараты между собой.

Исследование бисопролола и метопролола методом спектрофотометрии в УФ области спектра

Изучение спектральных характеристик бисопролола в УФ области спектра проводили с использованием растворов препаратов в ОДн соляной кислоте. Спектры абсорбции растворов снимали с помощью регистрирующего спектрофотометра UVmini-1240 в диапазоне длин волн 190-400 нм. Бисопролол в указанных условиях имеет максимум поглощения при 278 нм, метопролол - 274 нм.

Исследование бисопролола и метопролола методом ТСХ

Для исследования препаратов методом ТСХ на стартовую линию хроматографических пластинок «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ наносили по 10 мкг действующего вещества соответственно. Для хроматографического исследования использовали следующие системы растворителей:

1. ацетон (100%).
2. хлороформ — этанол (8:2).
3. хлороформ — этанол — 25% раствор гидрооксида аммония (20:5:1).
4. этилацетат — метанол — 25% раствор гидрооксида аммония (17:2:1).

Детектирование препаратов на хроматограммах производили реактивом Драгендорфа модифицированным по Мунье с последующей обработкой хроматограммы 20% раствором серной кислоты. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3 Значения Rf метопролола и бисопролола в различных хроматографических системах

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что лучшее разделение этих препаратов наблюдается в хроматографической системе хлороформ - этанол - 25% раствор гидрооксида аммония (20:5:1) (хроматографическая система № 3).

Исследование бисопролола и метопролола методом ВЭЖХ

Исследования проводили на жидкостном хроматографе «Мили-хром А 02». Условия хроматографирования: хроматографическая колонка «Prontosil-120-5C18» (75мм/2мм); элюент А-водный раствор кислоты трифторуксусной 0,1%; элюент Б-ацетонитрил; скорость потока 150 мкл/мин; количество подвижной фазы 2500 мкл с градиентом от 5 до 100% элюента Б; детектирование при 210,220,230,240,250,260,280 и 300 нм, с постоянной времени 0,1 с.

Спектральные отношения рассчитывали с использованием в качестве базового показателя длины волны 210 нм. Обработка полученных хроматограмм производилась с использованием компьютерной программы «Мультихром-Спектр» с базой данных БД-2003-250. Условия обработки: метод вычисления спектра - метод наилучшей чистоты; предельная величина угла- 10 градусов; окно по времени - 100%.

Хроматографические и спектральные характеристики бисопролола и метопрола представлены в таблице 4.

Таблица 4 Хроматографические характеристики бисопролола и метопролола

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что объемы удерживания и спектральные отношения бисопролола и метопролола достаточно сильно различаются. Это позволяет надежно дифференцировать эти препараты методом ВЭЖХ.

Исследование бисопролола и метопролола методом ГЖХ

Для исследования использовали газовый хроматограф «Кристалл 5000.1». Условия хроматографического разделения: температура термостата: колонок - 120°С в течение 5 мин., далее подъем температуры до 260°С со скоростью 10°С/мин; температура термостата испарителя - 240°С; температура термостата детектора — 260°С; газ-носитель - гелий, колонка капиллярная 30 м х 0,25 мм с привитой фазой НР-5MS, толщина фазы - 0,25 мкм. При исследовании бисопролола и метопролола на хроматограмме наблюдали пики с абсолютным временем удерживания 18,9 и 16,3 мин соответственно.

Разработанные методы идентификации бисопролола были апробированы на экспертном материале. В Алтайский краевой токсикологический центр поступил больной А., предположительно, с отравлением клофелином. У больного наблюдалось резкое снижение артериального давления, сердечная недостаточность, брадикардия. В результате проведения химико-токсикологического исследования по описанной выше схеме, в объектах исследования (моча) был обнаружен бисопролол, концентрация которого составила 0,9 мг%.

Выводы

1. Изучены условия изолирования бисопролола из биологического материала методами Васильевой и Карташова.
2. Показана возможность использования спектрофотометрии в УФ области спектра, ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, химических тестов для идентификации бисопролола.
3. Полученные результаты использованы в химико-токсикологическом анализе бисопролола.