К вопросу о возможностях методов генной инженерии при исследовании биологических объектов вещественных доказательств

Publication in electronic media: 20.07.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/300
Publication in print media: Актуальные вопросы теории и практики судебно-медицинской экспертизы, Красноярск 2007 Вып. 5

Е. Н. Исаева

Кафедра судебной медицины ИГМУ (зав. кафедрой д.м.н., профессор Ю. С. Исаев); ГУЗ Иркутское областное бюро судебно-медицинской экспертизы (начальник к.м.н., доцент В. Н. Проскурин), г. Иркутск

На сегодняшний день дела об установлении родства в делах о наследстве или назначении алиментов при спорном отцовстве, при гибели в катастрофах и террористических актах не должно обходиться без проведения генетической экспертизы, так как круг вопросов, которые она позволяет решить, очень широк.

Уникальность каждого человека определяется уникальностью его генома или, что по сути одно и то же, ДНК, являющейся хранилищем генетической информации. Помимо одинаковых практически у всех людей участков ДНК, кодирующих белки, существуют вариабельные участки, представляющие собой тандемные повторы с изменяющимся числом копий, обнаруживающие многоал-лельный полиморфизм по количеству мономеров. Аллелем называется возможная последовательность ДНК в одной и той же точке, т.е. применительно к повторам это означает, что у разных людей в одном и том же участке ДНК может встречаться различное количество мономерных единиц. Такой единицей может быть как один повторяющийся несколько раз нуклеотид, так и несколько десятков нуклеотидов, образующих тандемный ряд. Сочетания различных аллелей по нескольким повторам (локусам), лежащим на разных хромосомах, образуют генотип, характеризующий каждого человека. Чем больше маркеров анализируется в совокупности, тем больше вероятность уникальности такого сочетания, особенно, если каждый из маркеров обладает большим спектром возможных признаков(аллелей). В качестве объекта для выделения ДНК можно использовать любой биологический материал. Причем для идентификации достаточно совсем небольшого количества материала.

Получивший в последнее время широкое распространение метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет амплифицировать ("умножать") интересующие исследователя участки ДНК в миллионы раз, так что даже нескольких клеток в анализируемом образце будет достаточно для типирования (определения совокупности аллелей). В настоящее время существует несколько систем для типирования образцов ДНК, используемых для идентификации личности и установления биологического родства, но наиболее распространенной является система из 13 маркеров - CODIS (Combined DNA Index System), созданная в 1991 году в США. Она включила в себя системы, используемые к тому времени в Интерполе, стандарт Европейской системы судебно-научных институтов из 7 маркеров и систему судебных генетиков стран Южной Америки из 6 маркеров, из которых только 1 являлся общим с Европейской. Необходимость возникновения такой системы была обусловлена несколькими основными положениями: во-первых, требовались данные по частотам аллелей для разных популяционных групп; во-вторых, предполагалось создание единой для всех штатов базы данных, хранящей информацию обо всех тяжких преступлениях и дающей возможность в будущем идентифицировать как жертву, так и преступника.

В 1994 году девятнадцать штатов Америки объединили свои данные и начали работать по единому стандарту.

С появлением многоцветных флуоресцентных анализаторов фирмой Promega (USA) был создан набор PowerPlexl6, в который помимо маркеров, составляющих CODIS, вошел амилогенин-маркер, по которому возможно определить пол, и еще два дополнительных маркера, обладающих хорошей информативностью. С помощью этого набора в одной пробирке возможно протестировать образец сразу по 16 маркерам, что позволяет значительно интенсифицировать исследование. Существует еще ряд наборов для типирования, выпускаемых различными фирмами и используемых различными лабораториями, однако отличие их от CODIS препятствует как возможности создания единой базы данных по результатам типирования, так и свободному обмену данными между разными странами, что бывает актуально в ряде случаев.

Наиболее часто генетическую (или генотипоскопическую, или геномную дактилоскопию) экспертизу в гражданских делах назначают для установления отцовства или другого биологического родства. Как правило, перед экспертами ставят следующие вопросы: исключается или не исключается отцовство (материнство) данного индивидуума в отношении данного ребенка (плода); если отцовство (материнство) не исключается, то какова вероятность того, что полученный результат не является следствием случайного совпадения индивидуализирующих признаков не родственных лиц? Типирование (определение аллельного ряда по нескольким маркерам) каждого индивидуума и анализ соотношения выявленных аллелей между фигурантами дела позволяют ответить на эти вопросы.

Общеизвестно, что в клетке зародыша образуются 23 пары хромосом, которые будут передаваться во все клетки будущего организма практически без изменений, и, таким образом, ребенок может иметь только тот генетический материал, который есть у его биологических родителей. Обнаружение у ребенка признаков (аллелей), которых невозможно обнаружить у предполагаемого отца, однозначно, с абсолютной точностью, говорит о том, что это неродной его отец. Единственной тонкостью при таком исключении является количество несовпадающих локу-сов. Несмотря на достаточно низкую частоту мутирования, такие случаи описаны, и соответственно несовпадение отцовского (выявленного у предполагаемого отца) и не материнского (выявленного у ребенка и отличного от того, который получен им от матери) аллеля ребенка по одному локусу не может быть однозначно определено как критерий исключения отцовства.

По международным требованиям, принятым на Втором международном симпозиуме по идентификации человека в 1991 году, для исключения отцовства необходимо несовпадение как минимум по трем локусам.

Согласно Приказу Минздрава РФ «Об утверждении инструкции по организации и производству экспертных исследований в бюро судебно-медицинской экспертизы» N 161 от 24.04.2003, достаточно "как минимум двух не сцепленных локусов". Если у ребенка не обнаруживается аллелей, отличных от тех, которые есть у матери и предполагаемого отца, то всегда существует некоторая вероятность того, что данное совпадение признаков случайно. Не вдаваясь в математические формулы, по которым проводится расчет вероятности случайного совпадения совокупности генетических признаков (Р), отметим, что эта величина показывает принципиальную возможность гипотетического существования индивидуума, характеризующегося аналогичным сочетанием аллелей, и определяется исходя из статистических данных о частоте встречаемости аллелей каждого из маркеров в популяции.

Частоты некоторых аллелей значительно варьируют в зависимости от расовой принадлежности обследованной выборки, а также могут иметь некоторые популяционные особенности, поэтому для расчета вероятности необходимо использовать частоты той этнической группы, к которой принадлежат обследуемые. Однако вычисление вероятности (Р) не дает ответа на главный вопрос, призванный количественно охарактеризовать доказательственное значение экспертизы: если совпадение признаков установлено, то какова вероятность, что это совпадение закономерно, а не произошло по воле случайности? Для ответа на этот вопрос используют вычисленную с использованием теоремы Байеса величину, называемую вероятностью отцовства (англ. - Probability of Paternity, PP). Согласно Приказу Минздрава РФ № 161, уровень доказательности для экспертизы в России установлен как 99,9% для полного трио (мать - ребенок - предполагаемый отец). При отсутствии объектов исследования от одного из родителей доказательным для установления отцовства (материнства) считается значение 99,75%. Более низкое значение в случае дуэта обусловлено невозможностью в ряде случаев однозначно установить, какой же аллель ребенок получил от предполагаемого родителя, так как второй родитель неизвестен. Однако использование большего числа маркеров (локусов) позволяет достичь большего уровня доказательности, сравнимого с уровнем доказательности для трио.

Бывают ситуации, когда необходимо установить родство в отношении человека, которого уже нет в живых. Генетическая экспертиза может решить и эту задачу, причем несколькими способами.

Наиболее простым является анализ ДНК умершего, полученной из биологического материала патолого-анатомического образца. Такими образцами могут быть как парафиновые блоки с фрагментами органов и тканей, изъятые для гистологического исследования, так и сами гистологические образцы (стекла), а также хранящиеся в форхмалине органы.

В случае отсутствия патолого-анатомического материала возможно установление отцовства косвенным путем, т.е. проведение анализа без исследования ДНК предполагаемого отца, а использование ДНК бабушки и дедушки. Поскольку предполагаемый отец не мог получить никакой другой генетический материал, кроме того, который есть у его родителей, т.е. бабушки и дедушки ребенка, то у ребенка не должно быть других аллелей, кроме тех, один из которых совпадает с одним из аллелей его матери, а другой присутствует хотя бы у кого-то одного - либо у бабушки, либо у дедушки. В случае, когда противоречий не наблюдается, также рассчитывается вероятность случайного совпадения комплекса признаков (Р), показывающая принципиальную возможность гипотетического существования для данного ребенка пары индивидуумов в качестве бабушки и дедушки, характеризующейся аналогичным сочетанием аллелей.

Существуют и другие ситуации, которые требуют установления родства, например, между братьями или между сестрами при отсутствии родителей.

В случае однополых сибсов (детей одних родителей) возможно установление родства по материнской или отцовской линии. По материнской линии, т.е. от матери ко всем ее детям, но только от ее дочерей к внукам передается митохондриальная ДНК, что позволяет прослеживать женскую линию в поколениях. В митохондриальной ДНК выделяют два гипервариабельных региона (HVR), в которых существует множество точковых полиморфизмов. Совокупность различных нуклеотидов в той или иной позиции дает определенный митотип, который наследуется от матери к ребенку. Вследствие того, что различные варианты нуклеотидных замен расположены в небольшом по протяженности фрагменте митохондриальной ДНК, определение митотипов проводится путем- прямого секвенирования. Установление тождества митотипов позволяет с вероятностью 93 - 98% утверждать, что данные индивиды принадлежат к одной матрилинейной группе, т.е. имеют общего предка по женской линии. Доказательность этого утверждения ниже, чем при типировании по маркерам ядерного генома, но иногда это единственная возможность установить родственные отношения, При этом надо учитывать, что один и тот же митотип будут иметь и родные сестры, и двоюродные, матерями которых являются родные сестры, и тетя с племянницей и т.д.

Генетическим материалом, передающимся только по мужской линии, является У-хромосома, определяющая развитие организма по мужскому типу. На У-хромосоме, так же как на всех аутосомах, существуют полиморфные тандемные повторы - STR-локусы, которые тоже могут быть использованы для типирования. Наиболее информативными STR-маркерами У-хромосомы считаются следующие: DYS19, DYS389I, DYS389I1, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS3851/II, объединенные в так называемый минимальный гаплотип. Показано, что по результатам гаплотипирования по этому набору маркеров возможно отличить друг от друга представителей различных популяций с вероятностью более 99%.

Для массового скрининга на анализаторах нового поколения с использованием флуоресцентной метки фирмой Promega разработана система из 6 тетрануклеотидных повторов Y-PlexTM6, в которую входят маркеры DYS393, DYS19, DYS389I1, DYS390, DYS391, DYS385, позволяющие исследовать 7 локусов в одной пробирке. По результатам типирования строится гаплотип У-хромосомы, который заносится в базу данных, доступную через Интернет. Например, база данных www.ystr.org содержит на сегодняшний день информацию о 12802 минимальных гаплотипах, полученных при исследовании образцов ДНК из 83 Европейских популяций. Тождество гаплотипов У-хромосомы свидетельствует о том, что эти индивиды имели общего предка по отцовской линии, причем этот же гаплотип будут иметь и родные братья, и двоюродные, если их отцы родные братья, и дед с внуком, дядя с племянником.

Помимо установления родства генетическая экспертиза широко используется и при других правовых событиях. В частности типирование по У-хромосоме особенно актуально при анализе образцов, полученных при расследовании изнасилований, так как позволяет анализировать только биологический материал, полученный от лиц мужского пола. Анализ смешанных образцов следов, оставленных на месте преступления, помимо технических осооенностеи типирования еще представляет собой и сложную математическую задачу. Выявление в следах образцов ДНК от большого числа лиц не позволяет получать доказательных результатов в отношении фигурантов дела.

После определения аллелей необходимо установить их тождество в исследуемом образце вещественного доказательства и образце ДНК, полученном от подозреваемого. Расчеты проводятся так же, как и при установлении биологического родства, с той лишь разницей, что в качестве индивидуализирующего признака считается не шшель, переданный кем-то из родителей, а генотип целиком. Соответственно во всех расчетах учитывается частота встречаемости генотипа в популяции, а конечная оценка экспертизы представляет собой инкриминирующую вероятность (англ. Incrimination Probability -IP), рассчитанную из частоты встречаемости генотипа.

Таким образом, применение новейших методов генной инженерии для исследования полиморфизма генома человека позволяет индивидуализировать личность на тонком молекулярном уровне. Однако адекватное применение различных молекулярно-генетических маркеров в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления кровного родства возможно только при использовании референтных баз по частотам аллелей, полученных в той же популяции, или, по крайней мере, в той же этнической или территориальной группе населения, что и образцы, являющиеся предметом экспертных исследований.

Список литературы

1. Альберте, Е. Молекулярная биология клетки /Е. Альберте, Д. Еред, Дж. Льюис//М.: Мир, 1994. - Т. 2. -С. 287-301.
2. Иванов, П. Л. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифи-цированных фрарментов (ПДА Ф) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства /П. Л. Иванов // Методические указания. -Минздрав РФ, Москва, 1999. - С. 1 — 12.
3. Иванов, П. Л. Анализ нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДИК как метод судебно-медицинской идентификации личности и экспертизы родства /П. Л. Иванов //Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской службы РФ. Мат. V Всеросс. съезда судебных медиков. - 2001. -С. 251 - 253.