Изолирование и идентификация нимесулида в биологическом материале

Publication in electronic media: 20.07.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/298
Publication in print media: Актуальные вопросы теории и практики судебно-медицинской экспертизы, Красноярск 2007 Вып. 5

Н. А. Заздравных, И. В. Стаценко, Л. Г. Воронкова

Алтайское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы (нач. - В.А.Башмаков)

Нимесулид, торговое название «Найз», (4-нитро-2-фенокси-метансульфонанилид) относится к группе нестероидных противовоспалительных препаратов. Время достижения максимальной концентрации активности нимесулида в плазме крови- 1,5- 2,5 часа.

Связь с белками плазмы составляет 95%. Нимесулид метаболизируется в печени тканевыми монооксигеназами. Основной метаболит- 4-гидроксинимесулид (25%) обладает сходной фармакологической активностью. Нимесулид широко применяется как болеутоляющее, жаропонижающее и противоревматическое средство, выпускается в виде круглых двояковыпуклых таблеток белого цвета с желтоватым оттенком, порошка белого цвета.
Целью нашей работы является изучение возможности определения нимесулида в биологических объектах.

Изолирование нимесулида. Таблетка, содержащая 100 мг нимесулида, измельчалась, смешивалась с водой. Водная фаза подкислялась 20% раствором серной кислоты до рН=2 и экстрагировалась диэтиловым эфиром, затем хлороформом при рН=6-7 и при рН=9-10.
Идентификация нимесулида. Кислое, нейтральное и щелочное извлечения исследовались ТСХ методом на пластинках марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ и ВЭЖХ на микроколоночном жидкостном хроматографе «Ми-лихром А-02». Исследования проводились в камерах с системами растворителей:

1. Ацетон-100%,
2. Хлороформ - 96% этанол - 25% аммиак (20 : 5 : 1),
3. Хлороформ - ацетон (9:1).

Все 3 извлечения (нейтральное, кислое, щелочное) после хроматографии в вышеперечисленных системах без проявления имели пятна лимонно- желтого цвета с 1. Rf = 0,66. 2. Rf=0,56. 3.Rf=0,42.

После подсушивания пластинок при комнатной температуре свечения в УФ-лучах не наблюдалось.

Далее проводилось детектирование пластинок:

• с реактивом Драгендорфа усиления собственно- желтого цвета не наблюдалось;
• с реактивом Бушарда наблюдались желто- оранжевые пятна;
• с 10%) раствором едкого натра наблюдалось желто-лимонные пятна;
• с сульфатом ртути наблюдались белые пятна, при последующем проявлении хлороформным раствором дифенилкарбазона наблюдались розово - голубые пятна.

Нимесулид не дает реакций окрашивания с реактивами: 5% раствором хлорида окисного железа, концентрированными серной, азотной, соляной кислотами, с раствором формальдегида в концентрированной серной кислоте, Браттона-Маршалла.

Части извлечений из таблетки нимесулида растворяли в 0,1н растворе соляной кислоты и исследовали на микрокодоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ-детектором производства ЗАО «Эко-Нова» (Новосибирск). Исследование пробы осуществляли на хроматографической колонке размером 2x75 мм, заполненной обра-щено-фазовым сорбентом «Prontosil-120-5-C 18».

Условия хроматографирования: элюент А - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. Хроматографиро-вание проводили в градиентном режиме от 0 до 100% элюента Б в течение 25 минут.

Детектирование проводилось при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Скорость подачи подвижной фазы составляла 150 мкл/ мин, время измерения 0,10 секунд, температура термостата колонки - 35°С, объем вводимой пробы 1 мкл.

Спектральные отношения рассчитывались с использованием базового показателя длины волны 210 нм. Обработка полученных хроматограмм проводилась с использованием программы «Мультихром-Спектр» с базой данных БД - 2003-350. На хроматограмме извлечения нимесулида при рН = 9 наблюдался пик с объемом удерживания 1979 мкл, спектральные отношения которого составили: 220 нм - 0,699, 230 нм - 0,566, 240 нм -0,463, 250 нм - 0,350, 260 нм - 0,242, 280 нм - 0,312, 300 нм - 0,406. При УФ - спектрофотометрическом исследовании наблюдалось плато поглощения оптической плотности от 290 до ЗЗ0 нм, максимум поглощения при 298 нм.

Объемы удерживаний и спектральные отношения кислого, нейтрального и щелочного извлечений существенно не отличаются.

Нами был установлен удельный показатель поглощения нимесулида, который составил по нашим расчетам \см - 41 при длине волны 298 нм. Для этого порошок из таблеток «найз» экстрагировался этанолом, затем очищались методом ТСХ на силикаге-ле КСК, элюировались этанолом, фильтровались, высушивалось до постоянного веса при +50 град., получено однородное желтоватое вещество, которое идентифицировано жидкостной хроматографией как нимесулид. Стандартные растворы из точной навески нимесулида исследовались спектрофотомет-рией на «Спекорде М40».

Изолирование нимесулида из биологических объектов. Для выбора условий изолирования нимесулида из биоматериала было проведено сравнительное изучение двух методов изолирования: по Васильевой и подкисленным спиртом по методу Стаса-Отто в модельных опытах.

К 25 г свежей измельченной печени добавлялся нимесулид (раствор в этаноле) по 1, 3, 5, 7 мг. Пробы тщательно перемешивались и оставлялись при комнатной температуре на сутки. По истечении суток в первой серии опытов извлечения проводили подкисленной водой по методу Васильевой, во второй - подкисленным спиртом. Экстракция: из кислой среды диэтиловым эфиром при рН = 2, из нейтральной при рН = 6 - 7 и при рН = 9 - 10 хлороформом. Извлечения в органическом растворителе помещались в мерные колбы емкостью по 100 мл. Кислые извлечения по методу Стаса-Отто в опытах, где добавлено по 5 и 7 мг нимесулида, окрашены в желтый цвет. Желтого окрашивания извлечений по Васильевой не наблюдалось.

Для определения концентрации 0,5 части извлечений испарялись досуха, затем растворялись в 2мл 96% этанола, центрифугировались и исследовались на жидкостном микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» при вышеописанных условиях. На хроматограммах наблюдался 1 выраженный пик с объемом удерживания 1979 мкл. В таблице приведены результаты этих определений.

Сравнительная оценка методов изолирования нимесулида в биологическом материале

Как видно из таблицы, наибольший выход нимесулида из биоматериала был получен при изолировании подкисленным спиртом с последующей экстракцией диэтиловым эфиром из кислой среды - 23,9%. Часть нимесулида извлекается при рН = 6-1 и незначительно из щелочной среды.

Случай из практики. Больная С. приняла утром 100мг нимесулида. Через 3 часа был произведен забор мочи. Брали 100мл мочи, помещали в колбу, подкисляли 20% раствором серной кислоты до рН 2,0-2,5 и экстрагировали диэтиловым эфиром, затем извлекали при рН = 9-10 хлороформом. 0,5 часть кислого извлечения из мочи растворялась в 1 мл 0,1н раствора соляной кислоты, центрифугировались и исследовались на жидкостном микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» (условия хроматографирования указаны выше). В кислом извлечении из мочи пик (2019 мкл) по объему удерживания близок к пику кислого извлечения из таблетки нимесулида, но имеет несколько иные спектральные отношения (220 нм - 0,694, 230 нм - 0,711, 240 нм - 0,448, 250 нм - 0,157, 260 нм - 0,076, 280 нм - 0,104, 300 нм -0,012). Концентрация нимесулида, рассчитанная по плошади пика, составила 0,003 мкг/мкл. Хро-матографический пик в щелочном извлечении из мочи с объемом удерживания 2027 мкл имеет аналогичные спектральные отношения. Концентрация нимесулида, рассчитанная по площади пика, составила в щелочном извлечений 0,01 мкг/мкл.

ВЫВОДЫ:

1. Обнаружение нимесулида возможно методом ТСХ в общепринятых системах растворителей проявлением раствором едкого натра. У нимесулида низкий удельный показатель поглощения, поэтому УФспектрофотометрия для определения нимесулида в биоматериале не применима.

2. Для изолирования нимесулида из биологического материала может быть применен метод Стаса-Отто. Однако, метод недостаточно эффективен и позволяет выделить лишь 24% нимесулида. Необходимо продолжение экспериментальной работы для подбора других методов и условий изолирования, чтобы повысить выход этого вещества из объекта.