Расширенное микроскопическое исследование мелкодисперсных частиц в тканях внутренних органов

Publication in electronic media: 20.10.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/390
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и права, Казань 2010 Вып. 1

Социальные, экономические и медицинские аспекты немедицинского употребления наркотических веществ и трудности судебно-медицинской экспертизы при смерти в условиях неочевидности не позволяют снять с повестки дня обсуждение вопросов, связанных с диагностикой смертельных отравлений наркотиками. Согласно данным РБСМЭ МЗ РТ, по итогам 2006-2007 гг. отравления наркотическими веществами по РТ вышли на первое место среди всех случаев смертельных отравлений, опередив смертельные отравления алкоголем и угарным газом. По итогам 2008 года количество смертельных отравлений наркотическими средствами уменьшилось, заняв второе место после отравлений угарным газом (31,3%), и составило 28,9% из всех смертельных отравлений. При этом сохраняется тенденция ежегодного увеличения доли этих случаев в районах республики по сравнению с Казанью.

Более половины всех умерших составляют лица старше 30 лет, большинство из которых мужчины. При этом сохраняется тенденция «старения» лиц, употребляющих наркотические вещества. Все умершие находились в трудоспособном возрасте [1].

Посмертная диагностика наркотических отравлений и состояний, связанных с прижизненным употреблением наркотических веществ, начинается на месте происшествия с осмотра его и сбора катамнестических сведений, основывается на результатах секционного, судебно-химического и судебно-гистологического видов исследования.

Основным критерием для постановки диагноза смертельного отравления наркотическим веществом являются количественные результаты судебно-химического исследования биологических жидкостей и тканей внутренних органов трупа, однако существует целый ряд причин, в результате которых не изымается необходимый комплекс внутренних органов на судебно-химическое исследование. Например, результаты мониторинга смертельной интоксикации наркотическими веществами показали, что с каждым годом повышается количество таких случаев, в которых при судебно-медицинском исследовании не удалось обнаружить каких-либо следов инъекций: свежих инъекционных ран, рубцов, дорожек, «шахт» и пр. (табл. 1).

Таблица 1. Обнаружение инъекционных ран при смертельных отравлениях наркотическими веществами

Микроскопические методы диагностики могут подтвердить или опровергнуть факт прижизненного употребления наркотических веществ (особенно длительного) и оценить их роль в танатогенезе. Особую значимость микроскопические методы исследования приобретают из-за внутривенного введения наркотика, который является основным при употреблении опиоидов [4, 5, 6].

Высокое содержание примесей, используемых в качестве добавок к так называемым «наркотическим веществам», содержание которых в распространя-емых «дозах», по разным сведениям, может доходить до 90% и более, позволяет ожидать 100% обнаружение инородных частиц (ИЧ) в сосудах умерших в результате наркотической интоксикации [10, 12]. Однако мониторинг смертельных отравлений наркотическими веществами показал, что частота обнаружения ИЧ при обычной световой микроскопии составляет лишь от 8 до 24% случаев смертельных отравлений опиатами. Количество обнаруживаемых на светооптическом уровне ИЧ на препарат колеблется от 1 до 10 на всю площадь исследуемых гистопрепаратов. Величина их – не более 5 диаметров эритроцита, т.е. не более 40 мкм. Чаще всего ИЧ обнаруживаются при гистологическом исследовании в сосудах легких.

По мнению Ю.И.Пиголкина и С.В.Шигеева, решить проблему судебно-медицинской экспертизы отравлений наркотическими средствами и наиболее часто встречающимися в практике – опиатами – на основе традиционных описательных методов исследования невозможно. Для полноценного исследования таких случаев необходим комплексный подход с использованием современных методик, их совместным применением и интерпретацией [3, 9].

В связи с изложенным, группой авторов было проведено экспериментальное исследование гистологических образцов. Целью исследования стал поиск объективных критериев, позволяющих выявить и идентифицировать ИЧ именно в стандартно изготовленных гистологических препаратах, поскольку иногда, в силу малого количества частиц в исследуемом материале, не всегда есть возможность повторно выявить ИЧ во вновь изготовленных препаратах, даже в серийно изготовленных гистологических срезах. В качестве предполагаемых примесей нами были избраны крахмал и тальк. Оба вещества хорошо известны и находят достаточно широкое применение в быту.

Экспериментальные образцы были подвергнуты стандартной гистологической обработке, с последовательным проведением через спирты восходящей концентрации и заливкой в парафин, с изготовлением гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином, раствором Люголя и по Ван-Гизон, и заключением в полистирол [2]. Обнаруживаемые ИЧ описывались по количеству, расположению, распределению, а также по форме и очертаниям, наличию характерного рисунка или исчерченности, окраске.

Уже в условиях световой микроскопии было установлено сходство экспериментальных частиц крахмала и талька с обычно обнаруживаемыми ИЧ. При исследовании экспериментальных частиц в условиях фазового контраста отмечено, что и частицы талька, и частицы крахмала в таких условиях более отчетливо контрастируются по сравнению с фоном, что позволило заметно повысить степень их выявляемости в исследуемых препаратах текущих гистологических исследований (экспертиз). В условиях поляризационной микроскопии наблюдается свечение отдельных кристаллических частиц на темном фоне. Окраска на крахмал с использованием йодсодержащих реактивов позволила выявить в ряде случаев крахмал. Окраска по Ван-Гизон подтвердила морфологические признаки инкапсуляции отдельных ИЧ.

Экспериментальные образцы, а также тальк и крахмал, не подвергнутые какой-либо обработке, исследовали на базе криминалистической лаборатории Средне-Волжского регионального центра судебных экспертиз. Был использован метод качественного эмиссионного спектрального анализа на лазерном микроанализаторе ЛМА-10 с регистрацией спектров на многоканальном анализаторе атомно-эмиссионных спектров «МАЭС» со спектрографом PGS-2. Расшифровка спектрограмм проводилась по программе «Атом» с использованием базы данных спектральных линий «atom. Mega».

При визуальной оценке полученных спектрограмм было установлено, что спектрограммы экспериментальных частиц и образцов заметно не отличаются от фона. Несмотря на высокоточную идентификацию спектральных линий, оценка автоматического обзорного полуколичественного анализа концентрации элементов не позволила идентифицировать заданные вещества с достаточной степенью достоверности.

Учитывая восприимчивость отдельных ИЧ к красителям, были проведены микроспектрофотометрические исследования экспериментальных частиц также на базе криминалистической лаборатории Средне-Волжского регионального центра судебных экспертиз. Исследовались экспериментальные образцы, окрашенные гематоксилин-эозином. Исследования проводились на микроскопе ЕС-ЛЮМАМ РП-011. В качестве источника света использовалась галогеновая лампа накаливания.

При визуальной оценке полученных спектров пропускания было установлено, что они заметно отличаются только у кристаллов талька. Спектры пропускания крахмала и фибрина и, в меньшей степени, эритроцитов – схожи.

На этом же приборе были исследованы люминесцентные свойства частиц [8]. В препаратах, окрашенных йодсодержащим реактивом, люминесценции не наблюдалось; препараты, окрашенные по Ван-Гизон, имели очень слабую люминесценцию. Поэтому исследовались лишь экспериментальные образцы, окрашенные гематоксилин-эозином. При визуальном исследовании экспериментальных образцов установлено, что наблюдается ярко-желтое люминесцентное свечение эритроцитов и крахмала на зеленоватом фоне. При этом эритроциты и крахмал в стандартных гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, имели индивидуальные максимумы спектров люминесцентного свечения с учетом люминесценции стекла и полистирола, что нашло свое отражение в графиках спектров люминесценции. Люминесценции у кристаллов талька не было выявлено. Таким образом, результаты исследования люминесцентных спектров экспериментальных частиц дали нам еще один дополнительный критерий для идентификации инородных частиц.

Перечисленные методы исследования ИЧ информативны, значимы, но связаны с большими временными тратами, которые усугубляются и тем, что проводятся на разных по конструкции и использованию приборах, располага-ющихся не только в территориально разных помещениях, но и в различных учреждениях. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп “Leica TCS SPE” со спектральной детекцией на многоканальном анализаторе объединил в себе возможности перечисленных ранее приборов [7, 11].

Использованная модель микроскопа оснащена встроенным микроспектрофотометром, что позволило провести измерения спектров испускания выявленных ИЧ непосредственно в образцах. В качестве источника возбуждения использовался твердотельный лазер высокой мощности с выбранной длиной волны возбуждения из возможного набора в заданных диапазонах мощности и регистрации микроспектрофотометра. Остальные параметры настройки и расшифровка спектрограмм проводились в автоматически выбранном режиме в соответствии со встроенной программой, обеспечивающей работу прибора в целом: автоматизированный акустооптический делитель светового потока, ав-томатическая смена диафрагм и светоделительных пластин.

Были получены микрофотопрепараты ИЧ (инкапсулированных и располагающихся свободно в просвете сосуда) при разном освещении. При этом визуально была выявлена существенная разница в интенсивности излучения ИЧ по сравнению с окружающими тканями. Высокое разрешение прибора позволило провести точечные измерения в полученных изображениях исследованных образцов гистологических препаратов.

Конфокальный сканирующий лазерный микроскоп “Leica TCS SPE” поз-волил оценить количество, форму, взаиморасположение структур, а также увидеть ИЧ в объеме. Высокая чувствительность микроскопа дала нам дополнительное преимущество, расширив возможность визуализации и анализа гистологических препаратов. Кроме того, спектрофотометрическая детекция позволила произвести и количественные измерения высокой точности в стандартных условиях без повреждения исследуемых вещественных доказательств. Результатами проведенных исследований нами была установлена спектрофотометрическая идентичность экспериментальных частиц крахмала и талька с обычно обнаруживаемыми ИЧ.

Полученные результаты подтвердили возможность применения высоко-технологичного конфокального лазерного сканирующего микроскопа “Leica TCS SPE” при постмортальном исследовании отравлений наркотическими веществами для обнаружения ИЧ с определением их и последующей идентификацией в гистологических объектах.

Таким образом, изучение гистологических препаратов, изготовленных из парафиновых блоков, показало, что ИЧ в процессе гистологических методов обработки исследуемого материала сохраняются. Использование поляризационной, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии позволяет значительно повысить эффективность выявления ИЧ в тканях. Микроспектрофотометрия выявленных ИЧ дает возможность описать наиболее характерные признаки ИЧ в аутопсийном материале. Эмиссионный спектральный анализ не подходит для изучения состава ИЧ в стандартных гистологических препаратах. Применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа с микроспектрофотометром позволяет значительно повысить эффективность расширенного микроскопического исследования ИЧ в стандартных гистологических препаратах, выявить и изучить наиболее характерные признаки ИЧ. Применение расширенного микроскопического исследования, включающего описание микропрепаратов в условиях базовой и дополнительных окрасок с применением различных видов микроскопии, позволяет не только выявить, но и идентифицировать обнаруженную ИЧ при условии наличия в распоряжении исследователя качественного экспериментального образца предполагаемой примеси.

Список литературы

1. Александрова Л.Г. О динамике изменений некоторых показателей смертельных отравлений наркотическими веществами в Республике Татарстан (по результатам мониторинга). Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы трупа / Труды Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Санкт-Петербургского ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы». Под ред. В.А.Клевно и В.Д.Исакова. – СПб., 2008. – С. 118-122.
2. Микроскопическая техника: Руководство. Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. – М.: Медицина, 1996. – 544 с.
3. Морфологическая диагностика наркотических интоксикаций. Под ред. Ю.И.Пиголкина. – М.: Медицина, 2004. – 304 с.
4. Нигматуллин Н.Ш., Хромова А.М., Александрова Л.Г. и соавт. О возможности судебно-медицинской диагностики острой и хронической наркотической интоксикации // Клиническая фармакология и терапия. – 2005. – №4 (приложение). – С. 64-65.
5. Нигматуллин Н.Ш., Хромова А.М., Александрова Л.Г. и соавт. Методы исследования мелкодисперсных частиц в гистологических препаратах. Материалы Всероссийского совещания «О подготовке кадров для государственных судебно-медицинских экспертных учреждений. Современные процессы учебного процесса на кафедрах судебной медицины в учреждениях высшего и дополнительного профессионального образования». – Казань, 2006 – С. 228-231.
6. Хромова А.М., Александрова Л.Г., Забусов Ю.Г. Особенности гисто-структуры внутренних органов при острых и хронических отравлениях опиатами. Материалы ХIV пленума Всероссийского общества судебных медиков. – М., 1999. – С. 50-51.
7. Хромова А.М., Александрова Л.Г., Нигматуллин Н.Ш., Спиридонов В.А. Пути усовершенствования диагностики отравлений опиатами морфологическими методами. О проблемных вопросах организации производства судебно-медицинских экспертиз: сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции, Москва, 5-6 ноября 2009 г. Под ред. проф. В.В.Колкутина. – М.: РИО ФГУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России, 2009. – С.261-264.
8. Хромова А.М., Александрова Л.Г., Никифоров С.А и соавт. О возможностях использования люминесцентной микроскопии инородных частиц при постмортальной судебно-медицинской диагностике острой и хронической наркотической интоксикации // Проблемы экспертизы в медицине. – 2005. – Т.5 (июль-сентябрь). – №3. – С. 29-30.
9. Шигеев С.В. Судебно-медицинская экспертиза отравлений опиатами. Российский государственный медицинский университет Росздрава: Автореф… дисс. докт. мед. наук. – М., 2007. – 48 с.
10. Risser D., Uhl A., Oberndorfer F., Honigschnabl S., Stichenwirth M., Hirz R., Sebald D. Is the relationship between street heroin purity and drag-related emergencies and/or drug-relation deaths? An analysis from Vienna, Austria // Journal of Forensic Sciences 2007 v.52, № 5 – Р.1171-1176.
11. Timothy R.Corle, Gordon S. Kino. Confocal scanning optical microscopy and related imaging systems. . – San Diego, California: Academic Press. – 1996. – 353 p.
12. Wong S.C., Curtis J.A., Wingert W.E. Concurrent detection of heroin, fentanyl and xylazine in seven drug-related deaths reported from the Philadelphia medical examiner’s office // Journal of Forensic Sciences 2007 v.53, № 2 – Р.495 -498.