Количественный анализ окраски гистологических препаратов с применением цифровой микрофотографии

Publication in electronic media: 20.10.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/389
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и права, Казань 2010 Вып. 1

Судебно-гистологическое исследование является сложным, многоэтапным процессом исследования, в котором соблюдение качества изготовления гистологических препаратов является необходимым условием для возможности решения вопросов, стоящих перед врачом судебно-медицинским экспертом. Критериями оценки качества гистологических препаратов являются соответствие маркировки, внешняя аккуратность (оптимальная толщина гистологических срезов, их полнота, отсутствие разрывов, складок, пузырей, примесей и т.д.) и, конечно, соответствие результатов гистологической окраски препаратов технологии ее постановки. Целью окрашивания является более отчетливое выявление структурных элементов тканей. Оптимальные результаты окраски достигаются также тщательным соблюдением рекомендуемой прописи при приготовлении реактивов и точным выполнением инструкции. Все изменения в технологии окраски отражаются на качестве изготавливаемого гистологического препарата.

С психофизиологической точки зрения ощущение света создается в зрительном аппарате человека электромагнитными колебаниями с длинами волн от 380 до 780 нм, падающими в глаз человека. Волны этого диапазона обычно называют световыми, или видимым излучением. Ограничение спектра видимых человеческим глазом лучей явилось результатом многовекового приспособления к лучшему восприятию окружающего объективного мира. Граница чувствительности глаза со стороны коротковолновой части видимого спектра близка к наиболее коротковолновым солнечным лучам, проникающим на землю сквозь атмосферу (290 нм), поэтому чувствительность глаза к более коротким волнам не имела бы биологического смысла. Ограничение чувствительности со стороны длинноволновой части видимого спектра вызвано наличием тепловых излучений всех предметов. Без этого ограничения глаз воспринимал бы тепловые излучения даже собственных оболочек как свет и внешний мир был бы для него невидимым из-за собственных излучений глаза [1].

Цветовая гамма результатов гистологической окраски оценивается обычно субъективно, со всей гаммой физиологических (инерционность восприятия световых раздражений, пространственное усреднение цвета, ограниченная разрешающая способность цветового зрения) и психологических тонкостей (яркостная и цветовая адаптация), особенностями восприятия цвета, связанными с эффектами зрительного контраста (светового, цветового, последовательного). Будучи отнесенными к стандартному наблюдателю в определённых неизменных условиях, даже стандартные данные смешения цветов описывают фактически лишь физический аспект цвета, не учитывая изменения цветовосприятия глаза при изменении условий наблюдения или по иным причинам [2].

Для математического описания цвета используют цветовые координаты. В свою очередь из них можно получить координаты цветности, являющиеся основной характеристикой цвета. В цветовой системе каждый цвет может быть выражен тремя числами, представляющими собой значения координат, отсчитываемых по координатным осям. Эти три числа, физически соответствующие (для реальных цветов) количествам трех основных цветов в смеси (R – красный, G – зеленый, B – синий), зрительно уравнивающей данный цвет, называются координатами цвета [3].

В настоящее время рабочей является международная колориметрическая система XYZ с соответствующими ей координатами цвета X, Y, Z, принятая в 1931 году на VIII сессии Международной комиссии по освещению (МКО). Она была получена искусственно, путем пересчета из цветовых координат RGB с реальными основными цветами. Следует отметить, что в современной литературе, описывающей обработку цветных изображений с помощью компьютеров, встречается и термин система RGB. Однако, в отличие от системы МКО, речь в данном случае идет о цветах RGB, имеющих специфическую принадлежность к характеристикам цветопреобразующих узлов цифровых камер, сканеров, видеомониторов, принтеров и т.д. Эти приборы используются и в современной судебно-гистологической практике.

Целью настоящего исследования стало нахождение и отработка алгоритма получения и интерпретации показателей цветовых координат RGB для объективной оценки правильности полученного результата при использовании различных видов окраски: при внедрении метода окраски, при получении новой партии реактивов, в случае дистанционной консультации цифровых изображений гистологических препаратов и пр. Методика отрабатывалась на примере простого окрашивания препаратов при использовании одного красителя (раствор йода) и сложного – при использовании нескольких красителей (гематоксилина и эозина).

В первом фрагменте работы исследовалось изменение цвета препарата от преобладания того или иного компонента стандартной сложной окраски гематоксилин-эозином. Этапы технологической цепочки по оценке качества окраски в данном случае включали в себя следующие ступени:

1. Стандартная гистологическая обработка исследуемого материала (ИМ) с изготовлением гистопрепаратов, окрашенных гематоксилин-эозином [4].
2. Первичное исследование гистопрепаратов ИМ в световой микроскоп, субъективная оценка качества окраски.
3. Микрофотографирование.
4. Регистрация цветовых координат RGB с применением программных средств (в данном случае использовалась программа Adobe Photoshop).
5. Анализ полученных результатов и заключительные выводы о качестве и результатах гистологической окраски.

В роли ИМ был использован препарат, качество которого было признано исследователем эталонным и максимально соответствовало всем ожидаемым требованиям: аккуратный тонкий препарат с соответствующей маркировкой, синими (базофильными) ядрами и розовой (эозинофильной) цитоплазмой. Гистологическими объектами для контрольной оценки качества поставленной окраски являлись ядра и цитоплазма клеток. Кроме того, дополнительно были приготовлены препараты серийных срезов ИМ, окрашенные только эозином и окрашенные только гематоксилином. С изготовленных гистопрепаратов были сделаны микрофотографии, где были измерены цветовые координаты RGB с применением Adobe Photoshop. Результаты измерений, проведенных в ядрах и цитоплазме клеток, отражены в таблицах 1 и 2 соответственно.

Таблица 1. Цветовые координаты RGB в ядрах клеток

Таблица 2. Цветовые координаты RGB в цитоплазме клеток

Из полученных результатов следует, что при увеличении доли эозина при сложной окраске гематоксилин-эозином будет наблюдаться относительное увеличение «красной» составляющей в цветовой гамме. Увеличение «синей» составляющей при этом постепенно начнет убывать. В эталонном образце качественно проведенной сложной окраски гематоксилин-эозином имеет место минимальное значение «зеленой» составляющей, что наблюдается как в ядрах, так и в цитоплазме клеток (в данном случае, вероятно, имеет место взаимодействие двух красителей).

Во втором фрагменте работы исследовалась модель осваивания нового метода окраски. Для коррекции результатов окраски последовательность этапов алгоритма оценки качества в этом случае будет несколько расширена. Рассмотрим это на примере простого метода окраски парафиновых срезов раствором йода для обнаружения крахмала в гистологических срезах.

1. Стандартная гистологическая обработка контрольного образца (КО) и опытного образца (ОО).
2. Изготовление гистопрепаратов, окрашенных гематоксилин-эозином.
3. Первичное исследование гистопрепаратов ИМ в световой микроскоп, субъективная оценка возможности обнаружения частиц крахмала в ОО в сравнении с КО.
4. Окраска образцов КО методом, специфичным для патологического процесса или предполагаемого вещества. В нашем случае это было применение йодсодержащих реактивов для идентификации крахмала.
5. Окраска опытных образцов.
6. Сравнительное исследование ОО и КО.
7. Микрофотографирование.
8. Регистрация цветовых координат RGB КО и ОО с применением программных средств (в данном случае использовалась программа Adobe Photoshop).
9. Анализ полученных результатов. Заключительные выводы о результатах проведенного исследования (или качестве окраски).

Для исследования изменения цвета и с целью подбора оптимальной концентрации йода в реактиве для выявления крахмала были приготовлены водные растворы йода разной концентрации из официнального 5% спиртового раствора йода: 0,05; 0,1; 1%. Также использовался исходный неразбавленный 5% спиртовый раствор йода. Для отработки данной технологии был приготовлен КО с гранулами крахмала, подвергнутыми стандартной гистологической обработке с заключением в парафиновый блок.

Результаты измерений цветовых координат приведены в таблице 3.

Таблица 3. Цветовые коэффициенты RGB при окраске раствором йода

Результаты измерений цветовых координат подтвердили результаты предварительной визуальной оценки изготовленных гистологических препаратов, а также объяснили эффект «перекрашенных» йодом препаратов: при высоких концентрациях частицы крахмала и ткани были одинакового цвета. В максимальных концентрациях наблюдается снижение интенсивности пропускаемых лучей, что дает эффект черноты при визуальной оценке препаратов. С увеличением концентрации красителя не только увеличивается доля «красной» составляющей в пропускаемых световых лучах, но еще более интенсивно нарастает доля «синей» и «зеленой» составляющей. Объект становится более темным и не поддается визуальной дифференцировке.

С увеличением концентрации йода в реактиве цвет тканей и искомых частиц крахмала обретает все более насыщенный желтый цвет. С разбавлением йода водой цвет гранул крахмала смещается в «синюю» область. Но чересчур малые концентрации реактива не позволяют надежно визуализировать крахмал. Оптимальной для визуальной оценки наличия крахмала в гистологических срезах оказалась окраска 0,1% раствором йода. Точность измерения цвета можно повысить, проведя калибровку с использованием более узкого концентрационного шага реактивов.

Проведенное исследование продемонстрировало, что объективность по-лученных результатов окраски гистологических препаратов можно подтвер-ждать измерением цветовых координат RGB выявленных частиц. Исследование экспериментальных гистологических образов с целью обнаружения крахмала в гистологических образцах показало, что для его выявления в гистологических срезах оптимальна 0,1% концентрация йода.

Список литературы

1. Дукин В. П. Строение глаза и особенности зрения человека. – Казань, 1999. – 86 с.
2. Зверев Л. П., Овечкин И. Г. Цветовые измерения в космосе. – М.: Машиностроение, 1996. – 176 с.
3. Кривошеев М. И., Кустарёв А. К. Цветовые измерения. – М.: Энергоатомиздат, 1990. – 240 с.
4. Микроскопическая техника: Руководство. Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. – М.: Медицина, 1996. – 544 с.