Идентификация основных метаболитов верапамила при скрининге мочи методом ГХ/МС (сб. Барнаул 08)

Publication in electronic media: 11.06.2009 under http://journal.forens-lit.ru/node/73
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2008 Вып. 14

А.Б. Мелентьев

г. Челябинск

Верапамил 5 - [(3,4 - диметоксифенилэтил) - метиламино] – 2 - (3,4 -диметоксифенил)-2-изопропилвалеронитрила гидрохлорид (изоптин, финоптин и др.) относится к группе антагонистов кальция и широко применяется в клинической практике, так как обладает выраженным антиаритмическим, антиангинальным и диуретическим действием, стимулирует сократительную деятельность миокарда. Он нашел применение при лечении ишемической болезни сердца, тахиаритмии, артериальной гипертонии (Машковский М.Д., 1984). В практике нашего бюро регулярно встречаются случаи отравления верапамилом с летальным исходом. Препарат быстро выводится из крови (время полувыведения 2-7 час) и подвергается в организме интенсивной биотрансформации. Около 70 % верапамила выводится из организма с мочой за 5 дней преимущественно в виде метаболитов и только около 5 % выводится в неизменном виде (Moffat A.C. et all., 2000). Поэтому химико-токсикологический анализ биологических жидкостей организма для обнаружения фактов употребления верапамила должен предусматривать идентификацию его метаболитов. Особые трудности обнаружения факта употребления верапамила возникают при проведении анализа биологического материала после длительного проведения реанимационных мероприятий в больничных условиях. В этих случаях нативное соединение, как правило, не обнаруживается, а следы метаболитов верапамила могут быть найдены только при анализе мочи. Однако в большинстве коммерческих библиотек масс-спектров отсутствуют масс-спектры и хроматографические характеристики основных метаболитов верапамила и их производных, газово-хротатографический анализ которых производится ГХ анализ, что существенно затрудняет поиск маркеров употребления верапамила на хроматограммах экстрактов биологических сред при скрининге методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ/МС).

Целью данной работы явилось получение хроматографических и масс-спектральных характеристик некоторых производных основных метаболитов верапамила для надежного обнаружения фактов употребления верапамила при скрининге мочи.

Методика исследования

Оборудование: Газовый хроматограф 6890 с автосамплером 7683B и масс-селективным детектором 5975B. Кварцевая капиллярная колонка НР-5MS длиной 30 м внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки 0,25 мкм. Набор пипеток-дозаторов «Biohit», встряхиватель ABУ-6, термостат ТВ3-25 (Россия).

Материалы и реактивы: В работе использовали хлороформ и н-бутанол квалификации ЧДА, уксусный ангидрид и триэтиламин «ч» перегоняли перед использованием, пропионовый ангидрид фирмы Ferak Berlin", трифторуксусный ангидрид фирмы «Aldrich».

Образцы мочи для исследований были отобраны из экспертных образцов, в которых при скрининге были обнаружены верапамил и его метаболиты, а также при однократном приеме добровольцем 80 мг верапамила гидрохлорида фирмы «Alkaloid», Македония. Подготовка проб мочи для анализа проводилась по стандартной методике скрининга, опубликованной ранее (Мелентьев А.Б., 2002; Мелентьев А.Б., Старцев А.П., 2004). Отличались только конечные стадии получения производных. Для получения пропионовых производных к сухим остаткам после удаления растворителей добавляли по 40 мкл безводного триэтиламина и пропионового ангидрида, нагревали 20 мин при 90°С и удаляли избыток реактивов в потоке воздуха. Для получения трифторуксусных производных к сухим остаткам добавляли по 50 мкл трифторуксусного ангидрида, нагревали при 50°С 20 мин и удаляли избыток реактива в потоке воздуха.

Обсуждение результатов

На рис.1 приведена схема биотрансформации верапамила в организме человека по данным (Von Richter O. et. all., 2000), приведенные на схеме метаболиты были идентифицированы методом ВЭЖХ с масс селективным детектором.

Рис.1. Структурные формулы верапамила и его основных метаболитов.

Идентификация и расшифровка структур продуктов взаимодействия метаболитов верапамила с наиболее распространенными реактивами для получения летучих производных проведена по следующей схеме:

• На первом этапе выделялись все неидентифицированные пики на хроматограммах образцов, в которых обнаружен верапамил или его метаболиты. Как возможные продукты реакции метаболитов верапамила с ангидридами принимались только пики, которые обнаружены не менее, чем в двух различных образцах с верапамилом, но отсутствовали на хроматограммах экстрактов «холостых» образцов мочи, обработанных соответствующими дериватизирующими агентами.
• На втором этапе проанализированы все возможные продукты реакции ангидридов с известными метаболитами верапамила.
• На третьем этапе была проведена предварительная идентификация предполагаемых продуктов реакции метаболитов верапамила с ангидридами по их молекулярным ионам.
• На заключительном этапе в качестве подтверждения идентификации получены схемы характерной фрагментации молекулярного иона полученных продуктов под действием электронного удара.

В таблице приведены газохроматографические (времена удерживания и индексы удерживания по н-алканам на фазе НР-5) и масс-спектральные (основные характеристические ионы и их интенсивности) характеристики идентифицированных соединений. Как видно из таблицы 1, кроме обозначенных на схеме метаболитов верапамила, нам удалось идентифицировать еще один минорный метаболит, который является O-деметилированным производным соединения D-620, по аналогии с приведенной выше схемой деметилирования D-617 до D-717. Кроме идентифицированных производных метаболитов верапамила на хроматограммах большинства экстрактов, обработанных дери-ватизирующими агентами, обнаружены еще несколько пиков, которые не наблюдались в «холостых» образцах. Структуры этих соединений пока расшифровать не удалось. Производные метаболитов верапамила D-702, D-703 и D-715 (см. рис.1) на хроматограммах большинства экстрактов нами не идентифицированы, вероятно, из-за низкой концентрации этих метаболитов и их низкой летучести в условиях проведения ГХ анализа экстрактов мочи. Следует отметить, что интенсивности пиков различных метаболитов верапамила на хроматограммах отличаются иногда на 1-2 порядка, поэтому возникает необходимость выбора вещества – маркера потребления верапамила, который бы имел максимальную интенсивность сигнала.

Таблица 1.

Газохроматографические и масс спектральные характеристики продуктов взаимодействия метаболитов верапамила с некоторыми агентами для получения летучих производных.

На рис. 2 приведены кривые зависимости хроматографического сигнала основных метаболитов верапамила в ацетилированном виде в экстрактах мочи от времени, прошедшего после разового приема 80 мг верапамила г/х. Приведенные данные показывают, что маркером приема верапамила может служить пик его метаболита D-617, поскольку он имеет максимальную интенсивность сигнала для всего проверенного нами временного интервала. После 20 часов существенно возрастает интенсивность сигнала D-717, отношение сигналов двух этих метаболитов может указывать на длительность периода, прошедшего между однократным приемом препарата и отбором пробы. Пик нативного верапамила существенно меньше сигнала D-617 и не идентифицируется в экстракте уже через 15 час после приема.

Рис. 2. Временные зависимости интенсивности сигналов основных метаболитов верапамила в моче.

Список литературы

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.1. М.: Медицина, 1984. 624с.
2. Мелентьев А.Б. // Проблемы экспертизы в медицине, 2002. №4. C.15-21.
3. Мелентьев А.Б., Старцева И.П. // Суд.-мед. экспертиза, 2004. №6. С. 37-40.
4. Clarke’s analysis of drugs and Poisons./ Edited by A.C. Moffat, M.D. Osselton and B. Widdop. London: Pharmaceutical Press, 2004, 1632 p.
5. Von Richter O. et. all. // J. Chromatog. B., 2000. Vol.738. P. 137-147.