Особенности окраски и фиксации гемопоэтической ткани и ткани лимфоузлов

Publication in electronic media: 11.06.2009 under http://journal.forens-lit.ru/node/67
Publication in print media: Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики, Барнаул-Новосибирск 2008 Вып. 14

О.М. Зороастров, С.П. Гладышев, А.П. Барышников, Ю.В. Васильев, С.Э. Зайцев, М.А. Большаков

гг. Тюмень-Салехард

Большинство судебно-гистологических отделений не имеют возможности иммунологического определения типа и вида клеточных популяций. Нами предложено фиксация и способ обработки объектов исследования после первоначальной фиксации раствором формалина. Как известно, гематологические окраски (по Романовскому-Гимзе, по Май-Грюнвальду) подразумевают обязательную фиксацию в растворе сулемы (при фиксации растворами формалина гематологическая окраска зачастую непригодна для последующего цитологического и гистологического исследований). Многочисленные попытки замены сулемы иными солями металлов (железа, меди, хрома) оказались безуспешными. «Домысливание» при окраске гематоксилином-эозином красного костного мозга и лимфоидной ткани после фиксации в растворе формалина недопустимо, противоречит точности и пунктуальности русской морфологической школы, чьи выдающиеся успехи, как и сами ученые-морфологи (Давыдовский И.В., Головин, Глазунов и др.) признаны и почитаемы во всем мире. Показательным примером этого явилось признание учения об унитарной теории кроветворения проф. А.А. Максимова, высказанного им еще в начале ХХ века.

При совместном участии патологоанатомических отделений Облонкодиспансера и областной клинической больницы г. Тюмени (с Областным гемотологическим центром), нами предложена методика не только фиксации с приготовлением раствора сулемы in vitro, но и последующей декальцинации и гематологической окраски азурII-эозином гистологических срезов кроветворной ткани. Применение готового раствора по Романовскому-Гимзе дало неопределенные результаты, зачастую зависящие от качества партии красящей жидкости, что значительно затрудняет и продлевает время, условно определенное для постановки патогистологического диагноза. Применение ныне распространенного декальцинирующего раствора азотной кислоты приводит к значительным артефактам и неспособности воспринимать окраску гистологическими срезами.

Считаем целесообразным проведение методики без комментарий и многочисленных неразрешимых до сих пор вопросов гистохимии явления метахромазии при окраски гематологического морфологического материла.

Исходным материалом для получения сулемы является окись ртути желтая.

1. Приготовление 5% раствора сулемы из окиси ртути желтой.

К 100 мл. нагретой в конической колбе до 70-80О С бидистиллированной воды последовательно добавить 4,8 мл концентрированной соляной кислоты (удельный вес 1,19) и 4,0 гр окиси ртути желтой при помешивании раствора. Выпадающий при этом осадок металлической ртути и полупрозрачных взвешенных хлопьев монохлорида ртути полностью растворяется при дальнейшем помешивании раствора.

При остывании до 50ОС последовательно добавить при помешивании 2,5 грамма бихромата калия и 1 грамм сульфата натрия. Данная смесь представляет собой жидкость Ценкера, которую хранят в склянке с плотно притертой пробкой в темноте.

После вырезки материала, фиксированного в растворе формалина, смешивают 4,5 мл раствора Ценкера и 0,5 мл 40% формальдегида, заранее настоянном на меле (толщина кусочка ткани не боле 0,5 см).

Смесь Ценкер-формол используется однократно. Фиксацию проводят в течение 3-х часов с последующей промывкой в водопроводной воде 2 часа, обработкой разбавленным раствором Люголя (цвета крепкого чая) – 1 час и 0,25 % раствором тиосульфата натрия – 30 минут. Нет необходимости упоминать о применении перчаток при работе с солями ртути.

Декальцинация муравьиным декальцинатором при смешивании двух растворов:

1. 42,5 мл муравьиной кислоты и 7,5 мл дист. воды.
2. 10 грамм лимоннокислого натрия (натрия цитрата) и 40 мл дист. воды.

Декальцинацию проводят 18-24 часа с последующей обработкой 10% раствором алюмокалиевых квасцов – 10-12 часов, проточной водопроводной водой-1 час, 96О спиртом – в трех порциях по 3 часа в каждом с последующей заливкой в парафин.

2. Окраска азур II-эозином проводят в вертикальном положении предметных стекол. Для окраски используется 0,1% раствор азура II на 1% буре, причем раствор азура смешивают с бидистиллированной водой, а потом добавляют 0,01% раствор эозина.

Исходя из расчета – 5 мл бидистиллированной воды + 18 капсель азура + 25 капель эозина используют таблицу соотношений:

Окрашенный 20-40 минут срез, имеющий светло сине-красный цвет, дифференцируют, докрашивая в кислом 0,01% растворе эозина (1 капля уксусной кислоты на 200 мл красителя) с быстрым обезвоживание в спиртах. Мы получили хорошие визуальные данные при быстром последовательном обезвоживании в трех спиртах – этиловом, бутиловом, амиловом, с дальнейшим заключением в бальзам.
Анализируя качество окраски красного костного мозга, ткани лимфоузлов и селезенки следует указать на явные преимущества рекомендуемого способа приготовления фиксатора и красителей – такие как:

1. Фиксация проводится в химически однотипном, стойком растворе Ценкер-формола, основанного на классических рекомендациях проф. А.А. Максимова, не требует строгой отчетности расхода недоступного в настоящее время сулемы.
2. Декальцинация проводится в короткие сроки без образования известных артефактов и влияния кислот на последующую окраску срезов.
3. Применение 0,01% раствора эозина (в отличие от традиционно рекомендуемого 0,1 % раствора) применим ко всем сортам эозина.
4. Последовательное смешение 0,1% раствора азура II на 1% буре (натрий тетраборнокислый, 10-водный) и 0,01% раствора эозина приводит к стабильности раствора, без выпадения в осадок азура.
5. Смесь 0,1% раствора азура II на 1% растворе буры и 0,01% раствора эозина не влияет на феномен метахромазии кроветворных клеток.
6. Последующая после основной окраски дифференцировка с докрашиванием в подкисленном 0,01% растворе эозина приводит к закреплению самой окраски и к более насыщенному, классически описываемому цвету эозинофильных цитоплазматических структур кроветворных клеток.
7. При перекрашивании срезов возможно отмывание краски в спирте с последующим новым окрашиванием без образования метахроматических артефактов.
8. В эксперименте в течение 1 года стеклопрепараты красного костного мозга не выцветали, что свидетельствует о ее стабильности.
9. В эксперименте на мазках-отпечатках данная методика показала явные преимущества тона и оттенков цвета, в отличие от применяемого традиционного окрашивания реактивом Романовского-Гимзы на фосфатном буфере.
10. Данная методика возобновляет традиционную классическую гематологическую гистохимическую окраску, что позволяет пользоваться ранее изданными гематологическими морфологическими атласами, консультацию специалистов различных уровней, основанной на однотипности представления восприятия цветов и оттенков.

Верификация клонов гемопоэтической ткани возможна при окраске срезов и мазков по Слинченко с доокраской гематоксилином Бемера (ядра и ядрышки клеток гемопоэтической ткани окрашиваются в ярко красный цвет).

Думаем, что целесообразно подробно описать как сам метод окраски, так и приготовление красителей.

Раствор I (Хромотроп 2Б -0,2 гр, ледяной уксусной кислоты-30 мл, воды дистил.-70 мл). Приготовленный раствор темно-красный, прозрачный.

Раствор II- (Водный голубой- 0,2 гр, вода дист.-100 мл, ледяной уксусной кислоты- 6 мл). Приготовленный раствор темно-синего цвета, прозрачный.

Раствор III- 0.5 % фосфорно-вольфрамовая кислота.

Результат: мышечная ткань, фибрин, фибриноид- темно-красного цвета, эритроциты- огненно- красные, соединительная ткань – голубого и синего цветов.

Методика окраски:

1. Депарафинизация
2. Вода дистиллированная
3. Гематоксилин Бемера – 10 минут
4. Вода водопроводная – 10 минут
5. Вода дистиллированная – 1 минута
6. Раствор хромотропа 2Б – 1 минута
7. Вода дистиллированная 30 секунд
8. Раствор 0.5% фосфорно-вольфрамовой кислоты- до минуты (лучший результат – 40 секунд)
9. Раствор водного голубого – 15 секунд
10. Спирты, ксилолы, заключение.

Список литературы

1. Фрайштат Д.М. Реактивы и препараты для микроскопии // М.: Химия 1980.– 42 с.
2. Пирс Э. Гистохимия //М.: Иностранная литература 1962. – С. 245-247.
3. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия // М.: Мир 1969 – с. 450-454, 485-496
4. Фрайштат Д.М. Реактивы и препараты для микроскопии // М.: Химия 1980.– 356 с.
5. Ромейс Б. Микроскопическая техника М.: Иностранная литература 1953.